[发明专利]一种基因工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及一种基因工程菌及其应用。

背景技术

多数情况下，要高值化利用纤维素首先必须通过多种不同的纤维素酶对其进行有效降解。目前大多数的商业操作都是将15-20种不同的酶组合到一起制成酶制剂，其中包括三种主要的纤维素酶：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶(纤维二糖水解酶)和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶先从纤维素分子内部随机分解糖苷键，产生非还原性末端后，纤维二糖水解酶与之结合，从非还原性末端水解产生纤维二糖，纤维二糖再成为β-葡糖苷酶的分解底物而被降解成可发酵的葡萄糖。除了主要的纤维素酶，商业酶制剂中还会包括一些发挥辅助作用的酶类，用来增强纤维素酶的水解能力。由于天然纤维素大多具有复杂的结晶性结构，纤维素酶等水解酶在作用于此类纤维素时酶制剂用量大、糖化效率低，所以开发具有不同机制的酶系提高纤维素酶的效力尤为重要。

溶解性多糖单加氧酶(Lytic polysaccharide monooxygenase,LPMO)能通过氧化反应在纤维素的多糖链上添加氧基团使得其结构趋于松散更易断裂，为之后的进一步酶解提供基础。有研究发现，达到同样的水解转化率，添加溶解性多糖单加氧酶可以使纤维素酶用量减少一半。一些纤维素酶和半纤维素酶具有碳水化合物结合模块(Carbohydrate binding module,CBM)，它通过连接肽与催化结构域相连。天然木质纤维素的结构和化学性质非常复杂，所有纤维素酶作用于天然底物时都有不同程度的无效结合，而CBM可以通过靠近效应和靶标功能，特异性识别结合多糖底物，使催化结构域定位到目标底物附近，增加底物表面的有效酶浓度，提高纤维素酶的催化效率。

现有的具有内源性表达有CBM模块的溶解性多糖单加氧酶分泌能力的真菌往往具有酶分泌量很低并且不易分离纯化的缺陷，不能满足工业化生产的需求。目前，尚无具有CBM模块的溶解性多糖单加氧酶进行异源表达的报道。因此有必要开发一种具有较高的有CBM模块的溶解性多糖单加氧酶异源分泌能力的基因工程菌，从而提高纤维素类原料的处理效率，适应大规模工业化生产的需求。

发明内容

本发明的第一个目的在于克服现有技术中存在的有CBM模块的溶解性多糖单加氧酶内源性表达量低的缺陷提供一种具有CBM模块的溶解性多糖单加氧酶分泌能力高的基因工程菌。

本发明的第二个目的在于提供具有较高的有CBM模块的溶解性多糖单加氧酶分泌能力的基因工程菌的构建方法。

本发明的第三个目的在于提供所述基因工程菌的应用。

为了达到本发明的第一个目的，本发明提供了一种基因工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因为黄孢原毛平革菌溶解性多糖单加氧酶的编码基因。

本发明的发明人在研究中发现，黄孢原毛平革菌的溶解性多糖单加氧酶(暂将其命名为：溶解性多糖单加氧酶10320，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)是具有碳水化合物结合模块(CBM)的溶解性多糖单加氧酶，但是这种酶在黄孢原毛平革菌的内源性表达量低，不能适应于工业化生产的要求，为此，本发明的发明人研究提高溶解性多糖单加氧酶表达量的方法，从而提供了所述基因工程菌。

可选的，所述宿主细胞为酿酒酵母、汉森酵母或毕赤酵母。

可选的，所述宿主细胞为毕赤酵母GS115。

其中，所述基因工程菌内含有重组载体pPIC9K/Pc10320的核苷酸片段，所述Pc10320为SEQ ID NO：2所示的序列

本发明所提供的基因工程菌具有高的溶解性多糖单加氧酶10320分泌能力，并且所分泌的多糖单加氧酶10320能够对纤维素类原料进行高效的分解，葡萄糖释放量高。

为了达到本发明的第二个目的，本发明提供了基因工程菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：

重组载体构建：以黄孢原毛平革菌的基因组cDNA为模板，利用SEQ ID NO：3所示的序列为上游引物，SEQ ID NO：4所示的序列为下游引物通过PCR反应获得PCR产物，再用SnaB I和Avr II对PCR产物和pPIC9K载体进行双酶切后连接获得重组载体pPIC9K/Pc10320；所述Pc10320为SEQ ID NO：2所示的序列。

重组载体的转化：利用大肠杆菌感受态细胞扩增所述重组表达载体并收集扩增产物，将所述扩增产物用Sac1进行酶切后转化宿主细胞获得基因工程菌。

为了达到本发明的第三个目的，本发明提供了基因工程菌在纤维素类原料降解中的应用。