[发明专利]大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及大丽轮枝菌突变体菌株，尤其涉及大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株，本发明还涉及所述大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株作为背景菌株在大丽轮枝菌侵染机制、与寄主共存机理以及致病关键靶基因的研究等方面中的应用，属于大丽轮枝菌突变体菌株的构建及应用领域。

背景技术

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)是一种真菌病害，寄主范围非常广泛，能侵染棉花、番茄、亚麻、马铃薯、番茄、黄瓜、烟草、辣椒和茄子等两百多种经济作物，危害极其严重且药剂难于防治，成为作物生产发展的瓶颈。随着大丽轮枝菌小种VdLs.17基因组序列的成功测序(klosterman S.,Subbarao K.,Kang S.et al.Comparative Genomics Yields Insights into Niche Adaptation of Plant Vascular Wilt Pathogens.PLoS Pathogens,2011,Vol.7(NO.7))，并公布在了Broad Institute上，对大丽轮枝菌致病基因的研究和入侵过程中的分子机理的研究提供了有利的基因资源。然而，大丽轮枝菌入侵机制的研究还停留在初步阶段，病程相关基因的研究甚少。因此，利用“反向基因组学”研究大丽轮枝菌的致病机制显得更加重要。采用“反向基因组学”研究大丽轮枝菌致病基因的功能，主要是通过基因打靶获得相关基因的突变体分析基因功能。

真菌的基因打靶已有几十年的历史，目前实现多数真菌内源核基因的精确打靶还比较困难，究其原因是真菌体细胞内同源重组频率非常低下，远低于非同源末端连接(二者比例为1：10000～1：000)，以至于外源基因进入细胞后，绝大多数会借助非同源末端连接途径随机插入基因组中。

大丽轮枝菌野生型菌株基因打靶效率非常低，很难实现基因的精确打靶，严重妨碍了大丽轮枝菌入侵机制和与寄主共存机理的研究。因此，获得大丽轮枝菌Ku基因的缺陷突变体，有效提高大丽轮枝菌基因打靶效率成为亟待需要解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一株缺失Ku70基因的大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)ΔVdKu70缺陷突变体菌株，该突变体菌株能够显著提高基因打靶的效率，实现靶基因的精确打靶，应用于大丽轮枝菌侵染机制、与寄主共存机理以及致病关键靶基因的研究等方面。

本发明所要解决的上述技术问题是通过以下技术方案实现的：

本发明首先公开了一株缺失Ku70基因的大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株。本发明采用In-Fusion克隆技术构建Ku70基因的同源重组DNA片段并克隆至pGKO2载体上，构建基因敲除载体pGKO-Hyg-Ku70，转化农杆菌AGL-1，用于大丽轮枝菌的遗传转化。通过同源重组和大量的转化子筛选，最终从205个转化子中筛选获得一株敲除了Ku70基因的大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株，命名为Vd991ΔKu70-1。

本发明将获得的敲除了Ku70基因的大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株Vd991ΔKu70-1提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.10107；分类命名为：大丽轮枝菌Verticillium dahliae。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2014年12月02日；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

目前实现多数真菌内源核基因的精确打靶还比较困难，原因是真菌体细胞内同源重组频率非常低下，远低于非同源末端连接(二者比例为1：10000～1：000)，以至于外源基因进入细胞后，绝大多数会借助非同源末端连接途径随机插入基因组中；再考虑到对受体细胞的转化率(通常1％～5％)，借助同源重组成功打靶只得依赖大量受体细胞的使用，这导致前期转化和后期筛选繁重耗时，超出通常可承受范围，阻碍基因打靶(Krappmann S.Gene targeting in filamentous fungi:the benefits of impaired repair.The Mycologist,2007,(1):25-29.)。近年来，农杆菌介导的遗传转化在大丽轮枝菌中的成功应用，极大地提高了转化效率，为大丽轮枝菌的基因敲除奠定了基础。