[发明专利]快速全面检测药用单克隆抗体N糖基化位点上寡糖的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，具体涉及一种检测药用单克隆抗体N糖基化位点上的寡糖的方法。

背景技术

药用单克隆抗体(单抗)分子上的N糖基化对其稳定性和活性均具有重要的影响。N糖基化位点上的寡糖检测也对药用单抗生产的批次稳定性的监控至关重要。目前采用的单抗糖基化位点上寡糖检测方法为：运用特定的酶解反应(如使用肽N糖苷酶PNGase f)将糖基化位点上的寡糖切除下来，使用固相萃取等方法进行纯化,随后的检测包括：(1)对纯化后的寡糖进行荧光标记(如2-AA,2-AB等荧光试剂)，纯化后在配备荧光检测器的液相色谱上使用HILIC或氨基色谱柱进行分离，对洗脱峰进行分析。这种方法通常也是对分离寡糖进行半定量的方法；(2)对标记后的寡糖进行质谱(MS)分析，通常采用MALDI(基质辅助激光解吸电离)作为离子源，对寡糖信号荷质比进行分析，从而进行寡糖定性分析；(3)对标记或未标记的寡糖在配备MALDI/ESI(电喷雾电离)离子源的质谱上进行二级质谱分析，从而验证其结构；(4)将单抗分子直接酶解，对含有糖基化位点的多肽进行分析。

在液相色谱上对荧光标记的寡糖进行分析，对寡糖的定性鉴别只能依赖于洗脱时间。这需要事先标记、分析不同的寡糖标准品。通常情况下这些标准品都是已知结构的寡糖，制备工艺复杂，价格昂贵。而且不可能涵盖所有单抗上酶解的寡糖。一旦遇上未知样品在标准品没有涵盖的洗脱时间上出现，则无法予以鉴别。在这种情况下可采用解决的方法是多次进样进行色谱分析，在分析过程中收集相同位置的洗脱峰后合并、浓缩后应用MALDI质谱测定其分子量，从而推测其结构。整个结果繁琐、耗时。应用MALDI质谱也将酶解的寡糖以混合物的形式送入质谱仪，通过测量荷质比确定寡糖分子量，从而确定寡糖种类。但是由于从单抗上酶解下来的寡糖是以未经分离的混合物的形式送到质谱中检测，在每一个特定的荷质比上只能给出一个可能的定性的判断。对于同素异形体的问题(结构有差异的寡糖有可能有相同的分子量，从而在质谱中呈现完全相同的荷质比)则没有办法进行鉴别。含有糖基化位点多肽的方法需要依赖于对复杂多肽样品的分析，因为对于同一的糖基化位点会有各种不同的寡糖种类，其结构有时候会很相似，但当它们结合在多肽上(分子量通常在1500-2000Da)的时候，这些结构差异会变得更加小，使得依靠结构差异进行色谱分离变得更加困难。同时，含有寡糖的多肽通常依赖于反相色谱分离，这种分离方式对不同结构的寡糖通常不适用。目前的二级质谱技术仅能做到对已知结构的寡糖的确证，即先要有一个待确证的结构，然后在二级质谱上加以验证。并不能做到用二级质谱推断未知结构的寡糖。寡糖已知结构的建立目前还是要依赖上面阐述过的方法：荧光标记后HPLC分析和MALDI质谱对混合寡糖的分析。

发明内容

本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够快速、全面地检测药用单克隆抗体N糖基化位点上的寡糖的方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种快速全面检测药用单克隆抗体N糖基化位点上的寡糖的方法，其步骤如下：

1)样品寡糖酶解；

2)2-AB衍生化溶液配置；

3)寡糖的衍生化；

4)衍生后寡糖的纯化；

5)衍生寡糖的LC-荧光-ESI-MS分析：

用配备荧光检测器的高效液相色谱仪，以及与高效液相色谱仪相连的、具有ESI离子源的高分辨质谱仪进行检测，液相色谱条件为：流动相A:100mM甲酸铵水溶液，用甲酸调节pH至4.5；流动相B:乙腈；柱子:phenomenex Asahipak,5μNH₂P-50,150×2mm；柱温:50℃；进样体积:10μL；MS参数为：Vcap：4000V；Drying gas flow：10L/min；Gas temp：325℃；Fragmentor voltage：175V,m/z；range：300-3200。