[发明专利]快速全面检测药用单克隆抗体N糖基化位点上寡糖的方法

权利要求书

1.一种快速全面检测药用单克隆抗体N糖基化位点上的寡糖的方法，其步骤如下：

1)样品寡糖酶解；

2)2-AB衍生化溶液配置；

3)寡糖的衍生化；

4)衍生后寡糖的纯化；

5)衍生寡糖的LC-荧光-ESI-MS分析：

用配备荧光检测器的高效液相色谱仪，以及与高效液相色谱仪相连的、具有ESI离子源的高分辨质谱仪进行检测，液相色谱条件为：流动相A:100mM甲酸铵水溶液，用甲酸调节pH至4.5；流动相B:乙腈；柱子:phenomenex Asahipak,5μNH₂P-50,150×2mm；柱温:50℃；进样体积:10μL；MS参数为：Vcap：4000V；Drying gas flow：10L/min；Gas temp：325℃；Fragmentor voltage：175V,m/z；range：300-3200。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)的具体操作为：取50μg1μg/μL样品，加入2μL×10Denaturing buffer,加入8μL H₂O；100℃水浴10分钟，取出后放入冰中3分钟；用PNGase F酶解，脱盐纯化；加入4μL×10G7buffer；加入4μL10％NP40buffer；添加2μL PNGase F,加入10μL H₂O；1.837℃孵育样品过夜，取出后加500μL水为下一步脱盐纯化；碳黑小柱用700μL80％ACN，0.1％甲酸平衡，共2次；随后碳黑小柱用700μLH₂O洗涤2次；随后将PNGaseF酶解样品加到碳黑小柱上，并用700μL H₂O洗涤2次；用700μL20％ACN，0.1％甲酸洗脱碳黑小柱，洗脱液真空旋转蒸干；蒸干后的样品进行2-AB荧光标记。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)的具体操作为：乙酸与DMSO以15:35的体积比例混合，吸取100μL混合液，溶解5mg2-AB与6mg氰基硼氢化钠。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)的具体操作为：添加5μL2-AB衍生化溶液到样品中，涡旋混匀并用10,000rpm离心2min；将样品离心管置于65℃水浴3h；室温冷却样品，添加1mL95％ACN到每个离心管涡旋混匀。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)的具体操作为：添加1mL95％ACN到氨丙基固相萃取柱使其平衡；将样品加到平衡好的氨丙基固相萃取柱上，利用重力使其流过；使用1mL95％ACN平衡氨丙基固相萃取柱两次；使用1mL20％ACN将吸附在固相萃取柱上的标记寡糖洗脱，洗脱液浓缩至200μL；按照3/7的体积比例混合糖链溶液与ACN以备分析。