[发明专利]检测桃潜隐花叶类病毒的NASBA引物、试剂盒和方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种用于检测桃潜隐花叶类病毒的NASBA引物、试剂盒和方法，属于植物病原的检测技术领域。

背景技术：

桃潜隐花叶类病毒(Peach latent mosaic viroid，PLMVd)属于Avsunviroidae科，通常含338个左右核苷酸，无中央保守区。其在世界各地的桃栽培区均有发生，主要侵染桃、梨、李、杏等核果类果树：PLMVd在许多的桃树（Prunus persica）品种上为潜伏侵染，潜隐期可达5～7年，通常没有明显得叶部症状，但带毒桃树生长缓慢，树势衰退，抗性降低。感病品种染病后，在叶片上形成白色或黄色奶油状的花叶（Peach calico）或印花状病斑，褪绿斑驳（Peach blotch），或者是在小叶上形成边缘坏死的花叶症状（Peach mosaic）。病害发生于桃树生长第二年，症状包括延迟4-6天长叶、开花、成熟；高温时，花瓣出现紫色裂纹；果实不规则、扁状、色泽暗淡，裂果；芽坏死；桃树易早衰；有些强毒株系使叶片产生花叶、块斑、杂色和坏死；还有的能导致茎痘斑和卷叶。可经嫁接和桃蚜传染，随无性繁殖材料远距离传播。据报道，在我国有的果园桃树PLMVd发生较普遍，其造成的经济损失相当严重。目前尚未有桃潜隐花叶类病毒的恒温扩增方面的检测技术的发明报道。因此，建立简单实用的桃潜隐花叶类病毒新型检测鉴定方法，对于提高桃潜隐花叶类病毒的检疫检验效率、防止桃潜隐花叶类病毒的传入、传出，保护我国农业的安全生产，促进我国农产品的顺利出口，具有十分重要的意义。植物类病毒由于不显性侵染比较普遍，症状表现受环境温度的影响较大，而且几种鉴别植物对不同类病毒的反应症状相似，故难于应用生物测定的方法。由于类病毒不能产生任何蛋白质，所以也不能使用检测病毒的电镜、血清学方法。因此，选用分子生物学方法对桃潜隐花叶类病毒进行检测。

NASBA（Nuleic and sequence based amplipicain,NASBA）即“核酸序列依赖性扩增”检测技术是一种经典的恒温扩增技术，适用于单链核糖核酸RNA一步扩增及检测，已广泛应用于人类及动植物病原的检测与诊断。NASBA是由一对引物引导的,在含有T7 RNA聚合酶、RNAseH、反转录酶AMV、NTP、dNTP及需要使用的各种反应缓冲液所组成的标准反应体系中，通过连续均一的体外特异性酶促反应实现核苷酸序列的等温扩增。

由于细胞壁中富含大量的多糖、酚类物质，植物病毒RNA的提取存在着稳定性差、重复性低、效率低等问题，加之在提取过程中RNA本身的自降解现象，病毒RNA的含量往往较低，对检测方法的灵敏度和稳定性提出了较高要求。同时由于多糖等物质对于Taq聚合酶的抑制作用，限制了RT-PCR技术在葡萄、草莓、粮谷类等多酚含量较高的植物病毒RNA检测中的应用。由于NASBA技术的反转录过程被直接合并到扩增反应中，因此NASBA具备了适合于病原RNA的扩增、检测的特点，最适合各种RNA样品的分析，符合植物病毒检疫的要求，鉴于桃潜隐花叶类病毒危害的严重性，加强环境中的的监控，提高检测效率，对于有效控制桃潜隐花叶类病毒的传播在现阶段具有重要的实际意义。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是提供一种用于检测桃潜隐花叶类病毒的NASBA引物，试剂盒和方法。其主要原理是利用一对引物引导,在含有T7 RNA聚合酶、RNAseH、反转录酶AMV、NTP、dNTP及需要使用的各种反应缓冲液所组成的标准反应体系中，通过连续均一的体外特异性酶促反应实现核苷酸序列的等温扩增NASBA。经过循环反复，使RNA不断扩增，对样品中的桃潜隐花叶类病毒进行准确的检测。

本发明的实现，首先依据桃潜隐花叶类病毒全基因组序列设计特异性引物；再提取待测样品的核糖核酸（RNA），然后分别以特异性引物进行NASBA扩增；用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，最后根据NASBA扩增结果来判定样品中是否含有桃潜隐花叶类病毒。

本发明用于检测桃潜隐花叶类病毒的NASBA引物，其引物序列分别为 SEQ ID NO:1～2。

SEQ ID NO:1：

NA-P1:5’-aattctaatacgactcactatagggagGAGTGATGACCTCTCAGCCC-3’

SEQ ID NO:2：

NA-P2:5’-aattctaatacgactcactatagggagTTCTACGGCGGTACCTGGAT-3’

本发明提供的检测桃潜隐花叶类病毒的NASBA扩增试剂盒，包括如下组分：