[发明专利]检测桃潜隐花叶类病毒的NASBA引物、试剂盒和方法

权利要求书

1.检测桃潜隐花叶类病毒的NASBA扩增引物，其上游引物、下游引物的序列分别为 SEQ ID NO:1～2。

2.一种检测桃潜隐花叶类病毒的NASBA扩增试剂盒，包括如下组分：

（1）NASBA扩增反应液A:

每25 μL包括10×AMV buffer 2.5 μl，6.25mmol /L NTPs 3 μL，10 mmol /L dNTPs 1.5 μL，10 μmol /L引物NA-P1、NA-P2各0.5 μL，双蒸水9 Μl；

其中缓冲液为含40 mmol /L PH8.5 Tris-HCL，70 mmol /LKCL，12 mmol /L MgCL2，5 mmol /L DTT缓冲液；

（2）NASBA扩增反应液B:

0.5 U RNaseH，32 U T7RNA 聚合酶，6.4 U AMV 反转录酶，2 μL DMSO，0.1 μL1 mol /L 二硫苏糖醇，0.25 μL 10 mg /mL BSA，20 U RNA 酶抑制剂。

3.检测桃潜隐花叶类病毒的NASBA方法，包括下列步骤：

1）样品RNA的提取

A、取0.1 g样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入1.5 mL离心管中，加入1 mL Trizol Reagent，颠倒混匀，2℃~8℃，12000 g，离心10min；

B、取上清，15℃~30℃，放置5min；加入0.2 mL氯仿，用手剧烈震荡，不要涡旋振荡，15s；15℃~30℃，放置2min~3min；2℃~8℃，12000 g，离心15min；

C、吸取600 μL的上层水相，勿扰动中间相和下层相，加500 μL异丙醇混合上清液，15℃~30℃，放置10min，2℃~8℃，12000 g，离心10min；

D、去除上清液，沉淀中加入1 mL 75%乙醇，洗涤；2℃~8℃，7500 g，离心5min；

E、去除上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30 μL ~50 μL无RNase的水中，即为待检模板RNA；

2）进行PLMVd的NASBA扩增

A、 在装有14 μL环介导等温扩增反应液A的反应管中加入3μL 待检模板RNA；

B、在DNA扩增仪或水浴锅上65℃温浴5 min，立即转入41℃温浴5 min；

C. 在反应管中迅速加入4 μL反应液B；

D. 于41℃温育2 h；

E. 将金属浴调到4 ℃中止反应，3 min后取出；

3）电泳检测

取3 g琼脂糖，于100 mL 电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5 mg/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3 mL～6 mL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9 V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。