[发明专利]一种番茄溃疡病菌快速检测的方法及其专用引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速检测番茄溃疡病菌的方法及其专用引物。

背景技术

番茄溃疡病(Bacterial canker of tomato)是番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)生产中最为严重的病害之一，该病自从1909年首次在美国密执安州的温室番茄上发现以来，现已广泛分布于美国各番茄产区，并逐渐成为世界性病害。目前，在美洲、欧洲、亚洲、非洲和大洋洲的60多个国家都有番茄溃疡病发生危害的报道。该病害一旦发生没有有效措施控制，严重威胁着番茄的产量、品质以及采后果实的抗性，造成严重经济损失。

我国有关番茄溃疡病的记载始于1954年，目前该病在我国北京、黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、新疆、河北、山西、山东、上海、安徽、海南、广西等省、市、自治区都有发生，使许多地区番茄生产受到了不同程度的影响，近年来该病每年均有发生，且呈逐年扩散和加重的趋势。其中尤以甘肃、新疆、内蒙古、河北等省区为甚。2011年河北省望都县植保站对全县番茄大棚进行了系统调查，发现番茄溃疡病病棚率达75%以上。

引起该病的病原菌为密执安棒状杆菌密执安亚种（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Cmm），被列入我国检疫对象的名单。使用无菌种子和无菌苗是控制番茄细菌性溃疡病的首要措施，因此对番茄细菌性溃疡病的早期检测是控制该病传播和发生的有效手段。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是Notomi等于2000年开发的一种新的恒温体外核酸扩增技术，该技术利用能够识别靶DNA上6个特定区域的4条引物和有链置换活性的Bst（Bacillus stearo thermophilus）DNA聚合酶，使模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，在等温条件下使引物顺利与模板结合并进行链置换扩增反应。由于LAMP独特的核酸扩增机制，它的产物是由多重复靶序列的茎-环状DNA和花椰菜状DNA所组成的混合物，在琼脂糖凝胶电泳上会呈现出LAMP所特有的阶梯状条带。扩增产物不仅可以通过电泳检测，还可以添加SYBR Green I、溴化乙锭（EB）或其他核酸染色剂进行显色后观察。该技术具有高特异性、快速灵敏、高效、操作简便等特点，建立稳定、灵敏度高的LAMP反应体系，可以为番茄溃疡病菌的快速检测提供便捷服务。

本发明根据具有亚种特异性的番茄溃疡病菌ITS序列，设计了一组用于特异性检测番茄溃疡病菌的LAMP引物，并对反应温度和反应体系中甜菜碱、MgSO₄、Bst DNA聚合酶、dNTPs等试剂的使用浓度进行了优化，最终建立了番茄溃疡病病菌的LAMP检测方法，此体系在具备水浴锅和荧光染料的条件下，1 h左右的反应时间里就能够有效地检测到目的菌，而PCR扩增结合琼脂糖凝胶电泳检测通常需要花费 3-4 h甚至更长时间，因此在专业技术和实验设备不足的县市级植保植检部门，本发明建立的检测方法更具备实用性。

发明内容

本发明的目的是提供一组可用于检测番茄溃疡病菌的引物。

本发明的另一个目的是提供一种可用于快速检测番茄溃疡病菌的方法。

本发明所提供的用于检测番茄溃疡病菌的引物，是由序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4的核苷酸序列组成的引物对。

将由序列表中序列1、序列2、序列3和序列4的核苷酸序列组成的引物组命名为cmm-LAMP，序列表中SEQ ID No: 1由42个碱基组成，SEQ ID No: 2由41个碱基组成，SEQ ID No: 3由19个碱基组成，SEQ ID No: 4由18个碱基组成。

本发明所提供的快速检测番茄溃疡病菌的方法，是以待测番茄溃疡病菌标准菌株DNA为模板，在由序列表中序列1、序列2、序列3和序列4的核苷酸序列组成的引物组cmm-LAMP的引导下进行等温PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测可在100 bp-1000bp之间产生梯度条带，用SYBR Green I染色后可在扩增管中呈现橘黄色。