[发明专利]鉴定水稻CMS恢复基因Rf-1区段单倍型的分子标记及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物生物技术和分子育种领域，更具体地，涉及鉴定水稻CMS恢复基因Rf-1区段单倍型的分子标记及其应用。

背景技术

三系杂交水稻以其稳产、高产等优势，在种植面积上一直处于领先地位，为我国粮食安全做出了巨大的贡献。CMS(Cytoplasmic Male Sterility)即细胞质雄性不育,是三系杂交稻开发利用的物质基础，以此为基础开发的三系配套具体是指CMS恢复系、CMS保持系和CMS不育系。育种过程需要完成三系各自的保种和制备杂交种，具体操作是CMS保持系和CMS恢复系通过自交繁种；CMS不育系与CMS保持系杂交繁种；CMS恢复系做父本，与CMS不育系母本杂交可以制杂交种。我国杂交水稻CMS恢复系的选育历史上，CMS恢复系主要有野败型(WA)CMS恢复系和红莲型(HL)CMS恢复系，以及粳稻包台型(BT)CMS恢复系(万建民等，2008)。明恢63的培育成功具有里程牌式的意义，它兼具野败型CMS和包台型CMS恢复系的作用(Tang等，2014；Wang等，2006；Komori等，2004)；其次，9311是红莲型CMS恢复系的代表品系(Hu等，2012)。上述3种类型中控制着育性恢复的关键位点之一就是Rf-1基因及其相邻区间，它包括了野败型CMS恢复基因Rf4(Tang等，2014)、包台型CMS恢复基因Rf-1(Rf1a)和Rf1b(Wang等，2006；Komori等，2004)、红莲型CMS恢复基因Rf5(Rf1a)(Hu等，2012)。

传统育种中，恢复系的选育通过大田杂交测恢保关系，工作量大，组合有限，而利用分子标记可以在室内快速鉴定恢复基因的等位类型，提升育种的预见性，减少不必要的测交组合，从而提高育种效率。在分子标记辅助育种中，当前该基因座位的常用分子标记可分为两种，一是紧密连锁的标记，二是功能标记(陈涛等，2013)。在大规模选择中这两类标记都有一定的缺陷，前者会有目的基因丢失的现象，后者在育种实践中只能够鉴别其中一个基因座位的基因型，且两种标记都会伴随非预期性状的带入，即存在连锁累赘的问题。

基于CMS恢复基因Rf-1位点的基因定位克隆研究，已经认识到该位点的恢复基因都属于PPR家族成员，具有较高的DNA序列同源性，常规的InDel区分彼此之间的差异非常困难，而SNP分布广、数量多，是开发鉴别该位点基因家族成员彼此之间差异标记的有效来源。因而，通过开发区段内分布合理的多个以SNP标记为主的组合，可以鉴定种质资源的Rf-1区段的单倍型，同时，可以在培育三系杂交水稻中，鉴定Rf-1区段导入片段大小范围，选择更加合适的改良单株后代，有效克服连锁累赘。最终，达到同步解决多个基因座位的基因型鉴定及连锁累赘的问题，进而，提升育种技术水平。

Life Technologies公司(http://www.lifetechnologies.com/)的TaqMan OpenArray技术是将TaqMan-MGB探针技术与OpenArray芯片技术相结合的高通量基因分型技术。TaqMan-MGB探针技术是已经成熟应用的水解携带荧光基团的杂交探针获取荧光信号的检测技术。OpenArray芯片技术是将反应控制在33nl的微孔内进行的微阵列技术，一张芯片上设有3072个微孔，由48个方阵组成，按4行12列排布，每个方阵由64个微孔组成，按8行8列排布。芯片上可以灵活地选择检测的目标数目，如16个，32个，64个，128个和256个；相应的检测样品数为144份，96份，48份，24份和12份。OpenArray芯片灵活的检测目标数目与检测样品数的组合方案可以为不同规模的检测提供成本控制更加合理的选择。

发明内容

本发明的目的在于提供了鉴定水稻CMS恢复基因Rf-1区段单倍型的分子标记。

为实现本发明目的，本发明首先利用新一代测序技术，对水稻野败型和包台型CMS恢复系亲本明恢63、红莲型CMS恢复系亲本9311、自主培育的优良恢复系G527和水稻野败型保持系亲本珍汕97进行全基因组重测序，与参照品种日本晴测序数据进行比对，选定Rf-1基因及其上下游各200kb约遗传距离1cM区间范围，发掘多态性位点。共获得水稻CMS恢复基因Rf-1区段多态性位点32个。

具体地，本发明筛选水稻CMS恢复基因Rf-1区段多态性位点的方法包括以下步骤：