[发明专利]从动物肺脏中分离硫酸乙酰肝素的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种从动物肺脏中分离硫酸乙酰肝素的方法。

背景技术

硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)属于黏多糖类化合物，因其组成糖基和糖苷键连接方式上与肝素相似而得名。但其糖链中以由β-D-葡萄糖醛酸和2-N-乙酰氨基2-去氧α-D-葡萄糖(包括C6-O-硫酸酯取代)通过(1→4)连接的双糖单位为主。HS是与肝素紧密相连但又独立的一类糖胺聚糖(Casu,2005)。同肝素相比HS硫酸化程度较低，而乙酰化程度较高。

肿瘤是当今世界上发病率最高、对人类健康和生命危害极大的疾病。据统计，近几年在中国，死于肿瘤的人数占死亡总人数比例超过25％，部分地区超过30％，且死亡人数及比例正逐年增加。目前，并无很好的治疗性药物，对该类药物的开发仍然是世界上的研究的热点。最新研究表明，HS是近年来研究发现可以通过调节免疫功能和抑制肿瘤细胞的转移而发挥抗肿瘤作用的新的多糖类药物。目前，以HS为原料，通过酶工程或化学法来制备其衍生物，是世界研究的热点，以其得到药理作用强、副作用小、疗效高的新产品。因而，该产品具有广阔的应用前景。其药理作用强、无明显的毒副作用是其突出特点，由牛肺或猪肺来源的HS具有很强的抗肿瘤和抗血栓活性。

我国是世界上产牛、猪、羊等哺乳动物的大国，每年都有大量的牛肺、猪肺和羊肺等没有很好的利用，以其为原料开发有高生物活性的硫酸乙酰肝素将具有巨大的经济效益和社会效益。国内尚未有开发该产品的报道，开发该产品，可出口原料药，也开发为国内新药。

发明内容

本发明的目的是提供了一种从动物肺脏中分离硫酸乙酰肝素的方法。

本发明所述的一种从动物肺脏中分离硫酸乙酰肝素的方法，包括以下步骤：

1)盐水提取：将肺脏捣碎，然后加入其重量30-40倍2％的NaCl水溶液(w/v)，温度控制在90-95℃，搅拌5-6h，离心，分别收集上清液和沉淀，向沉淀中加入80-120倍2％的NaCl水溶液(w/v)，重复上述操作2-3次；

2)酶水解：合并步骤1)中的上清液，调节pH为9-11，温度为40-50℃，加入水解酶，搅拌20-24h，然后升温至90-95℃，保温2-3h，离心，弃去沉淀，向上清液中加入乙醇，沉淀12-18h，得沉淀物；

3)氧化脱色：在步骤2)所得的沉淀物中加入其重量30-60倍的2％NaCl水溶液，控制溶解液温度为40℃-50℃，pH为9-11，加入溶解液体积0.1％的KMnO₄和0.2％的活性炭，室温搅拌6-8h，离心去除沉淀，向上清液中加入1倍体积的乙醇沉淀12-18h，得沉淀物；

4)丙酮分级沉淀：在步骤3)所得的沉淀物中加入其重量30-60倍的2％NaCl水溶液，搅拌溶解，加入0.6-1.3倍体积的丙酮，沉淀12-18h，离心收集沉淀，重复上述操作3次，向沉淀物加入2-3倍体积的乙醇，充分搅拌，静置过滤去除乙醇，真空干燥得硫酸乙酰肝素粗品；

5)超滤：向硫酸乙酰肝素粗品中加入80-120倍体积纯化水，搅拌溶解，循环超滤3-5h，收集截留液；

6)离子交换柱层析：选择强阴离子交换树脂对5)中的截留液进行交换吸附，先以2-3倍体积的0.5-1mol/L的NaCl溶液进行洗脱；再用2-3倍体积的1.5mol/L的NaCl溶液洗脱，收集洗脱液；

7)凝胶过滤层析：对6)中的洗脱液进行凝胶过滤层析，收集洗脱液；

8)浓缩：对7)中的洗脱液进行超滤为原体积的1/20-1/30，收集截留液；

9)凝胶过滤脱盐：对8)中的洗脱液进行凝胶过滤脱盐，收集洗脱液；

10)冻干：将步骤9)所得的洗脱液冻干，得到硫酸乙酰肝素精品。

所述步骤2)酶水解过程中，所述水解酶为胰蛋白酶、核糖核酸酶II中的一种或二者的组合。

所述步骤2)酶水解过程中，胰蛋白酶的用量为为肺脏重量的0.5％-2.0％，加入乙醇的量为上清液体积的2-3倍。

所述步骤5)中，选用截留分子量为5000-7000Da的超滤膜。

所述步骤7)中，采用Sephadex G-100制备层析柱进行洗脱。

所述步骤9)中采用Sephadex G-10层析柱进行洗脱。

选用截留分子量为2000-4000Da的超滤膜。

所述动物肺脏为哺乳动物肺脏。