[发明专利]从动物肺脏中分离硫酸乙酰肝素的方法

权利要求书

1.一种从动物肺脏中分离硫酸乙酰肝素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)盐水提取：将肺脏捣碎，然后加入其重量30-40倍2％的NaCl水溶液(w/v)，温度控制在90-95℃，搅拌5-6h，离心，分别收集上清液和沉淀，向沉淀中加入80-120倍2％的NaCl水溶液(w/v)，重复上述操作2-3次；

2)酶水解：合并步骤1)中的上清液，调节pH为9-11，温度为40-50℃，加入水解酶，搅拌20-24h，然后升温至90-95℃，保温2-3h，离心，弃去沉淀，向上清液中加入乙醇，沉淀12-18h，得沉淀物；

3)氧化脱色：在步骤2)所得的沉淀物中加入其重量30-60倍的2％NaCl水溶液，控制溶解液温度为40℃-50℃，pH为9-11，加入溶解液体积0.1％的KMnO₄和0.2％的活性炭，室温搅拌6-8h，离心去除沉淀，向上清液中加入1倍体积的乙醇沉淀12-18h，得沉淀物；

4)丙酮分级沉淀：在步骤3)所得的沉淀物中加入其重量30-60倍的2％NaCl水溶液，搅拌溶解，加入0.6-1.3倍体积的丙酮，沉淀12-18h，离心收集沉淀，重复上述操作3次，向沉淀物加入2-3倍体积的乙醇，充分搅拌，静置过滤去除乙醇，真空干燥得硫酸乙酰肝素粗品；

5)超滤：向硫酸乙酰肝素粗品中加入80-120倍体积纯化水，搅拌溶解，循环超滤3-5h，收集截留液；

6)离子交换柱层析：选择强阴离子交换树脂对5)中的截留液进行交换吸附，先以2-3倍体积的0.5-1mol/L的NaCl溶液进行洗脱；再用2-3倍体积的1.5mol/L的NaCl溶液洗脱，收集洗脱液；

7)凝胶过滤层析：对6)中的洗脱液进行凝胶过滤层析，收集洗脱液；

8)浓缩：对7)中的洗脱液进行超滤为原体积的1/20-1/30，收集截留液；

9)凝胶过滤脱盐：对8)中的洗脱液进行凝胶过滤脱盐，收集洗脱液；

10)冻干：将步骤9)所得的洗脱液冻干，得到硫酸乙酰肝素精品。

2.根据权利要求1所述的从动物肺脏中分离硫酸乙酰肝素的方法，其特征在于，所述步骤2)酶水解过程中，所述水解酶为胰蛋白酶、核糖核酸酶II中的一种或二者的组合。

3.根据权利要求1或2所述的从动物肺脏中分离硫酸乙酰肝素的方法，其特征在于，所述步骤2)酶水解过程中，胰蛋白酶的用量为为肺脏重量的0.5％-2.0％，加入乙醇的量为上清液体积的2-3倍。

4.根据权利要求1所述的从动物肺脏中分离硫酸乙酰肝素的方法，其特征在于，所述步骤5)中，选用截留分子量为5000-7000Da的超滤膜。

5.根据权利要求1所述的从动物肺脏中分离硫酸乙酰肝素的方法，其特征在于，所述步骤7)中，采用Sephadex G-100制备层析柱进行洗脱。

6.根据权利要求1所述的从动物肺脏中分离硫酸乙酰肝素的方法，其特征在于，所述步骤9)中采用Sephadex G-10层析柱进行洗脱。

7.根据权利要求1所述的从动物肺脏中分离硫酸乙酰肝素的方法，其特征在于，选用截留分子量为2000-4000Da的超滤膜。

8.根据权利要求1所述的从动物肺脏中分离硫酸乙酰肝素的方法，其特征在于，所述动物肺脏为哺乳动物肺脏。