[发明专利]一种产细菌素植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL活菌制剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域的乳酸菌活菌制剂的制备方法，属于微生物应用领域，可用于家禽畜牧业中饲用活菌制剂等微生态制剂的生产。

背景技术

乳酸菌是一种存在于人类体内的益生菌。乳酸菌能够将碳水化合物发酵成乳酸，因而得名。将益生乳酸菌添加到食品中不仅可以提高食品的营养价值，而且具有保健作用，如促进蛋白质等营养物质的吸收，产生维生素B族等大量有益物质，改善人体肠道功能，恢复人体肠道内菌群平衡，增强人体免疫力，抗肿瘤、抗衰老，还具有降胆固醇、降血脂、降血压等作用。目前市场上的乳酸菌制品主要包括酸乳，酸乳饮料，活菌制剂等。

本专利涉及的一株产细菌素植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL菌株，经过试验证实其不仅对单增李斯特氏菌有很好的抑菌效果，而且耐受胃肠逆环境(耐受胆汁和胃酸)，因此可以顺利通过胃肠定殖于肠道中产生细菌素和乳酸，具有抑制某些腐败菌和致病菌的作用。本专利将该菌株制备成活菌制剂作为生物添加剂应用于家禽养殖业，可以达到预防家禽肠道疾病的目的。

目前，国内专利有关各种活菌制剂的制备方法较多，例如北京市农林科学院季海峰和苏布敦格日乐申请的“一种猪源植物乳杆菌植物亚种冻干制剂及其制备方法”(CN200910082441.X)是植物乳杆菌植物亚种经扩培、离心、加入保护剂、真空干燥，获得高存活率的植物乳杆菌植物亚种菌粉；黑龙江八一农垦大学于长青、钱丽丽和姚笛申请的“含有活性物质的植物乳杆菌活菌制剂及其制备方法”(CN201010283999.7)是在植物乳杆菌活菌粉中加入低聚糖，制备一种可在温室稳定存放的活菌制剂；上海环伟生物科技有限公司张琴和陈建吕申请的“一种复合微生物活菌制剂及其制备方法和应用”(ZL200810034746)是一种片球菌、酵母菌和芽孢杆菌复合微生物活菌制剂。但关于利用产细菌素植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL制备活菌制剂，并利用油菜籽蛋白胨作为替代氮源，马铃薯浆作为基质保存生物制剂中活菌的方法国内外未见相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种产细菌素植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL活菌制剂的制备方法。

所述方法中，植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang-LL，已于2012年12月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研 究所)，其保藏号为：CGMCC No.6936。在MRS培养基中培养2d，菌株Zhang-LL菌体呈短杆状，0.5×1.33～2.0μm，单个，成对或呈短链状排列，不生芽孢，革兰氏阳性。

所述方法中，植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL活化2～3代后，将活化好的菌液以2％(V/V，体积分数)的接种量接种至改良MRS液体培养基中，37℃培养12h，获得的培养液备用。

上述方法中，改良MRS液体培养基：胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母浸粉5.0g，柠檬酸三铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.25g，水1L，pH6.5，121℃灭菌15min

所述方法中，植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL发酵培养基是在改良MRS培养基的基础上进行氮源的替代及优化的。培养基和发酵条件优化采用单因素多水平和四因素三水平[L₉(3⁴)]正交试验，以测定发酵液活菌数为指标，分析并确定了高活菌数发酵液的优化的培养基和发酵条件。最终确定氮源(501油菜籽蛋白胨)含量3.0％、发酵温度34℃、发酵液pH 6.5、发酵接种量7％为最优发酵培养条件。优化的植物乳杆菌植物亚种的发酵培养基一一501油菜籽蛋白胨改良MRS培养基由以下成分组成：501油菜籽蛋白胨30.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐温801.0mL/L，乙酸钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.25g/L，pH6.5，121℃灭菌15min。

所述方法中，应用上述优化后的发酵培养条件，利用5L全自动发酵罐进行高密度发酵，将Zhang-LL菌株的扩大培养液按7％(V/V，体积分数)的接种量接种至发酵罐中，利用发酵罐自动控温系统保证发酵温度为34℃，发酵过程中以流加15％(V/V，质量体积比浓度)的灭菌Na₂CO₃溶液控制发酵液pH为6.5，转速为150r/min的条件下发酵16h，获得发酵液。