[发明专利]山羊LYRM1基因单核苷酸多态性位点的检测方法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及山羊LYRM1基因单核苷酸多态性位点的检测。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型变异的SNPs约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。

根据对遗传性状的影响，基因多态性又可分为两种：一种是同义突变多态性，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的“含义”相同；另一种是非同义突变多态性，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNPs的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响；尤其对于无义密码子突变来说，更可能会导致所编码的蛋白发生重大变化，从而影响它的功能发挥，对个体的表现型产生重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。

近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)和直接测序技术等。SSCP可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变。Takao经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90％可被SSCP发现，他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来。另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯。用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段。该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器。

胰岛素是能量代谢中的一种合成代谢激素，在调节糖类平衡方面具有重要作用。胰岛素可以促进葡萄糖转运。肥胖往往伴随着胰岛素抵抗。胰岛素抵抗是在胰岛素起作用的目标组织(例如肝脏、骨骼肌以及脂肪组织)中胰岛素作用减弱的一种病理学状态。胰岛素和胰岛素受体(IR)结合，催化细胞内底物如IRS蛋白发生酪氨酰基磷酸化。IRS-1蛋白在胰岛素代谢中具有重要作用。胰岛素受体介导的IRS磷酸化激活两种信号通路来抑制葡萄糖转运。PI3K-蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB/Akt)信号通路对于控制葡萄糖摄取的胰岛素活性以及抑制葡萄糖异生起重要作用。LYRM1基因是与人类肥胖相关的易感基因，其编码的蛋白在N端临近区域存在一高度保守的三肽基序——LYR结构域，属于NADH复合物元件。LYRM1通过降低PI3K和Akt的磷酸化水平来降低胰岛素刺激状态下的葡萄糖的摄取。LYRM1基因分布较广泛，在各种组织中都有发现。肥胖群体的网膜脂肪组织中LYRM1基因高丰度表达，在骨骼肌中的表达量也很高，研究表明该基因能够促进前体脂肪细胞的分化，并且抑制其细胞编程性死亡，并且可能参与线粒体的功能以及能量代谢。因此，研究哺乳动物LYRM1基因遗传变异和分子遗传特征具有重要理论和实践意义。

目前，对于LYRM1基因遗传变异的研究较少，着重在小鼠和人类肥胖症上。国内外关于家畜LYRM1基因遗传变异的研究，目前在山羊中还未见相关报道。由于LYRM1基因对于维持正常体重，胰岛素敏感性以及葡萄糖代谢所必需，目前亟需提供一种检测方法为LYRM1基因SNP与体尺性状关系的建立奠定基础，以便用于山羊生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的山羊种群。

发明内容

本发明目的在于提供一种山羊LYRM1基因单核苷酸多态性位点的检测方法及检测试剂盒，以加快良种选育速度和提高种群品质。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

山羊LYRM1基因单核苷酸多态性位点的检测方法，包括以下步骤：

(1)以待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增山羊LYRM1基因部分序列；

所述的引物对P为：

上游引物(SEQ.ID.NO.1):5’ACAGGCTTAGTTGCTCCC 3’

下游引物(SEQ.ID.NO.2):5’TTCAGTCTTCTGCCCACA 3’

(2)对PCR扩增产物进行SSCP检测：PCR扩增产物经变性剂变性处理后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果结合测序判定多态性位点的基因型，所述多态性位点为：