[发明专利]鉴别南方红豆杉幼苗的分子特异性标记引物及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴别南方红豆杉Taxus chinensis的分子特异性标记引物，以及一种利用该特异性引物对南方红豆杉进行快速鉴别的方法。

背景技术

南方红豆杉Taxus chinensis是裸子植物亚门 （Cymnospermai）松杉纲（Coniferopside）红豆杉目（Taxales）红豆杉科 中(Taxaceae) 红豆杉属 (Taxus)植物，是我国特有的第四纪孑遗植物，主要分布于长江流域、南岭山脉山区及河南、陕西、 秦岭、甘肃等省的山地或溪谷。南方红豆杉既有重要的观赏价值，又有重要的药用价值。其中含有的紫杉醇更是重要的治疗癌症药物。由于自然繁殖更新能力较低，加上人类过度砍伐，导致南方红豆杉数量越来越少，目前已处于濒危状态。在幼苗期间，南方红豆杉T. chinensis与曼地亚红豆杉T. madia及东北红豆杉T.cuspidata的茎和叶型相似度非常高，利用形态学鉴别方法很难将南方红豆杉与其它两种红豆杉区分开。因而，在过去的很多年里，将曼地亚红豆杉T. madia及东北红豆杉T.cuspidata错误鉴定为南方红豆杉T. chinensis的情况时有发生。

对3种红豆杉辨别的主要特征是宏观上差异并不是很显著的叶或茎的性状。但是形状特征易受生境、气候、生理状况等的影响而常常导致主观辨别上的偏差，而对幼苗期间的样本，仅靠叶、茎的形状差异更是难以准确鉴定。因此，在红豆杉分类研究上，分子标记技术成为了对红豆杉标本辅助鉴别的重要手段。

真核生物的核糖体基因rRNA的内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer, ITS）的保守性非常强。种内ITS序列相对一致，而种间差异比较明显，这一特点使得ITS序列不仅适合于属内物种间的系统发育分析，而且非常适合于植物物种的分子鉴定。对南方红豆杉T. chinensis、曼地亚红豆杉T. madia及东北红豆杉T.cuspidata的ITS区序列测序结果显示，T. chinensis、T. madia和T.cuspidata的ITS（ITS1-5.8S-ITS2）序列长度均为1100bp左右。因此，很难运用通用ITS引物（ITS4/ITS5）的PCR扩增、普通电泳对3个相似种进行准确鉴别。通过对三个相似种的ITS序列比对分析发现三者的局部序列存在碱基差异，本研究根据这一特点，设计开发了用于鉴别南方红豆杉的ITS特异性引物。本发明为南方红豆杉及其相似种的分子辅助鉴别提供了可能性，对有效的鉴别和保护南方红豆杉种质资源具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的一个目的是针对现有技术的不足，提供了一种可鉴别南方红豆杉T. chinensis与其2个相似种（曼地亚红豆杉T. madia及东北红豆杉T.cuspidata）幼苗的分子特异性标记引物。

本发明开发一种鉴别南方红豆杉T. chinensis与其相似种（曼地亚红豆杉T. madia及东北红豆杉T.cuspidata）幼苗的分子特异性标记引物，其核苷酸序列如下：

上游引物NHSF：5’-CCCGAAGTGTCGCCGGGCAGCC-3’，如SEQ ID NO.1所示；

下游引物NHSR：5’-TCCGCACAAATCCGTGACCTCG-3’，如SEQ ID NO.2所示。

此对分子特异性引物是采用普通PCR技术，经过对南方红豆杉T. chinensis与其2个相似种（曼地亚红豆杉T. madia及东北红豆杉T.cuspidata）幼苗样本的核糖体ITS区序列的克隆测序，然后对测序获得的3个相似种ITS序列进行碱基差异比对，并以此设计分子特异性引物（NHSF/NHSR）。上述引物对具有极高的专一性，用此对引物对T. chinensis，T. madia和T.cuspidata进行PCR扩增，可以从T. chinensis中获得695 bp大小的特异性片段。