[发明专利]一种植物组成型过量表达载体、分枝且高产油菜的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种植物组成型过量表达载体、分枝且高产油菜的制备方法。

背景技术

油菜(Brassica napus L.)不但是世界上仅次于大豆的第二大食用油脂植物而且同时也是植物油和植物蛋白的主要来源之一，占我国油料作物总产量的40％～45％。油菜不是一个单一的物种，它包括芸薹属中许多种，根据我国栽培的油菜植物形态特征，遗传亲缘关系，结合农艺性状，栽培利用特点等可分为三大类型：即白菜型油菜(Brassica campestris)、芥菜型油菜(Brassica juncea)和甘蓝型油菜(Brassica napus L.)。甘蓝型油菜(Brassica napus L.，AACC2n＝38)是由芸薹(AA2n＝20)和甘蓝(Brassica Olercea，CC 2n＝18)通过自然种间杂交后自然加倍进化而来的一个复合种。

DHHC(Asp-His-His-Cys)型锌指结构域是一种富含半胱氨酸高度保守的锌指结构域，常出现在DNA结合蛋白中的一种结构基元。属于类C₂H₂型锌指，其序列特征为：C-X₂-C-X₉-HC-X₂-C-X₄-DHHC-X₅-C-X₄-N-X₃-F(C代表半胱氨酸；H代表组氨酸；X代表任意氨基酸)。

目前，对DHHC型锌指结构域的研究主要集中在酵母和哺乳动物，植物中的DHHC型锌指蛋白研究相对较少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种植物组成型过量表达载体、转基因油菜的制备方法，旨在通过所获得的植物组成型过量表达载体构建一种分支数和产量都增加的油菜新品种。

本发明是这样实现的，一种植物组成型过量表达载体，该表达载体由35S启动子驱动OsDHHC1基因和GUS基因形成的融合基因，即35S：：OsDHHC1-GUS；其中，所述OsDHHC1基因是水稻中编码DHHC型锌指蛋白的Os02g0819100基因的另外一种剪接方式，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明进一步提供了上述植物组成型过量表达载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)以水稻cDNA为模板，通过引物进行PCR扩增；其中，所述引物为：

OsDHHC1基因引物-F：

5’-CATGCATGCCATGGTGCTGGCACATATATCTCTTATGTC-3’，

OsDHHC1基因引物-R：

5’-GGAAGATCTGGAAGATCTGTTGTTTGTGATCTGGAACTCAGTG-3’；

(2)将步骤(1)中的PCR扩增产物克隆到pUCm-T载体中，经测序鉴定后，用NcoI和BglII双酶切pUCm-T载体和pCAMBIA1301载体，分别回收小片段和大片段，然后进行连接；

(3)将步骤(2)得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α，经抗生素筛选获得阳性克隆；提取阳性克隆的质粒，得到植物组成型过量表达载体。

优选地，在步骤(3)中，所述转化的方法是农杆菌介导的遗传转化方法。

优选地，在步骤(3)中，所述转化的方法为将所述植物组成型过量表达载体电击转化农杆菌GV3101，经100μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素筛选获得阳性克隆，再进行农杆菌介导的遗传转化。

本发明进一步提供了一种分枝且高产油菜的制备方法，包括以下步骤：

(1)通过上述植物组成型过量表达载体转化甘蓝型油菜植株；

(2)通过抗性筛选和RT-PCR鉴定得到获得分枝且高产油菜。

优选地，在步骤(1)中，所述转化采用农杆菌介导的转基因方法。

优选地，所述步骤(2)具体包括：

对T1代幼苗进行潮霉素抗性筛选，获得的抗性幼苗实行单株收种；

对T2代幼苗继续进行潮霉素抗性筛选，获得纯合子转基因株系；

采用RT-PCR方法对获得的纯合子转基因株系进行鉴定，获得目的基因OsDHHC1表达量明显增加的转基因纯合子株系。