[发明专利]一种L-草铵膦-N-羧酸酐及其制备和应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种L-草铵膦-N-羧酸酐及其制备和应用，特别涉及在嗜烟碱节杆菌WYG001(CCTCC NO：M 2014054)酯水解酶作用下进行立体选择性水解制备新型光学纯L-草铵膦-N-羧酸酐，再应用L-草铵膦-N-羧酸酐经水解开环反应制得L-草铵膦的应用。

(二)背景技术

草铵膦，又名草丁膦，是德国Hoechst公司研制的除草剂，通用名为glufosinate。草铵膦低毒、高效、广谱的特点，广泛应用于果园、葡萄园、橡胶及棕榈园、观赏性灌木、非耕地防除一年生和多年生的双子叶禾本科杂草，并用于马铃薯田、森林和高山牧场等经济型作物。近年来，由于转基因抗除草剂作物取的重大进展，特别是抗草甘膦和抗草铵膦类经济作物，其种植面积最大，市场需求量也在增大。与草甘膦相比，草铵膦对多年生恶性杂草有较好的防治效果同时对耐受草甘膦的部分恶性杂草也有较好效果，因此草铵膦在除草剂市场中有较强的优势。

草铵膦具有两种不同的对映体，但只有L-草铵膦(S-草铵膦)具有植物毒性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。因此，制备光学纯的L-草铵膦对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力都具有十分重要的意义。

目前，文献报道的化学法合成L-草铵膦通常步骤冗长，合成路线复杂，收率低，且手性拆分试剂昂贵。相比之下，本发明所利用生物法具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高及产物易分离纯化的优点。

(三)发明内容

本发明为了解决上述方法的不足，提供一种可以制备L-草铵膦的中间体L-草铵膦-N-羧酸酐，以及L-草铵膦-N-羧酸酐的制备方法，利用嗜烟碱节杆菌WYG001(CCTCC NO:M 2014054)作为生物催化剂，立体选择性催化水解拆分外消旋DL-草铵膦-N-羧酸酐，制备L-草铵膦-N-羧酸酐。

本发明的另一目的是应用L-草铵膦-N-羧酸酐再经水解开环脱羧反应制得L-草铵膦。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种如式(Ⅳ)所示的L-草铵膦-N-羧酸酐，

本发明还提供一种式(Ⅳ)所示的L-草铵膦-N-羧酸酐的制备方法，具体所述的方法为：以嗜烟碱节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)WYG001经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经冷冻干燥后的干菌体为酶源，以DL-草铵膦-N-羧酸酐为底物，以pH 7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为反应介质，在20～50℃、200rpm条件下进行反应(优选反应1-30h)，反应完全后，将反应液分离纯化，获得式(Ⅳ)所示的L-草铵膦-N-羧酸酐；所述嗜烟碱节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)WYG001，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 2014054，保藏日期2014年2月28日，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

进一步，所述湿菌体的用量以缓冲液体积计为3～150/L，优选10-100g/L，更优选10-30g/L，所述干菌体的用量以缓冲液体积计为1～50g/L，优选5-30g/L，，更优选10-30g/L，所述底物的初始浓度为1～50g/L缓冲液，优选5-35g/L。

本发明所述酶源的制备方法为：(1)斜面培养：将嗜烟碱节杆菌WYG001接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得菌体斜面；每升斜面培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)组成：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，pH 7.0-7.2，加水至1000mL；121℃灭菌20min。

(2)种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在30℃、200r/min培养24h，获得种子液；种子培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH 7.0；

(3)发酵培养：在无菌条件下，以体积浓度6-8％的接种量将种子液接种于产酶培养基中，30℃、200r/min培养24h，获得发酵液，培养结束后将发酵液12000rpm离心10min，弃上清液，得到嗜烟碱节杆菌WYG001湿菌体；产酶培养基组成为：乳糖8-12g/L，酵母膏12g/L，NaCl 10g/L，MgSO₄0.22g/L、KH₂PO₄0.136g/L，溶剂为水，pH 7.0；