[发明专利]一种L-草铵膦-N-羧酸酐及其制备和应用

权利要求书

1.一种如式(Ⅳ)所示的L-草铵膦-N-羧酸酐，

2.一种制备权利要求1所述的L-草铵膦-N-羧酸酐的方法，其特征在于所述的方法为：以嗜烟碱节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)WYG001经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经冷冻干燥后的干菌体为酶源，以DL-草铵膦-N-羧酸酐为底物，以pH 7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为反应介质，在20～50℃、200rpm条件下进行反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得式(Ⅳ)所示L-草铵膦-N-羧酸酐；所述嗜烟碱节杆菌WYG001，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 2014054，保藏日期2014年2月28日，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

3.如权利要求2所述L-草铵膦-N-羧酸酐的制备方法，其特征在于所述湿菌体的用量以缓冲液体积计为3～150g/L。

4.如权利要求2所述L-草铵膦-N-羧酸酐的制备方法，其特征在于所述干菌体的用量以缓冲液体积计为1～50g/L。

5.如权利要求2所述L-草铵膦-N-羧酸酐的制备方法，其特征在于所述底物的初始浓度为1～50g/L缓冲液。

6.如权利要求2所述L-草铵膦-N-羧酸酐的制备方法，其特征在于所述的反应在20～50℃、200rpm条件下反应1～30h。

7.如权利要求2所述L-草铵膦-N-羧酸酐的制备方法，其特征在于所述酶源的制备方法为：

(1)斜面培养：将嗜烟碱节杆菌WYG001接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得菌体斜面；每升斜面培养基组成：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，pH 7.0-7.2，加水至1000mL；

(2)种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在30℃、200r/min培养24h，获得种子液；种子培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH 7.0；

(3)发酵培养：在无菌条件下，以体积浓度6-8％的接种量将种子液接种于产酶培养基中，30℃、200r/min培养24h，获得发酵液，培养结束后将发酵液12000rpm离心10min，弃上清液，得到嗜烟碱节杆菌WYG001湿菌体；产酶培养基组成为：乳糖8-12g/L，酵母膏12g/L，NaCl 10g/L，MgSO₄0.22g/L、KH₂PO₄0.136g/L，溶剂为水，pH 7.0；

(4)取步骤(3)湿菌体以1.2g/ml的量加入pH 7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀，-80℃条件下冷冻干燥，得到干菌体。

8.如权利要求2所述L-草铵膦-N-羧酸酐的制备方法，其特征在于所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液过滤，滤液用碳酸氢钠或0.5M的盐酸调节pH到6.5-7.0后用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层用水洗涤后减压蒸馏至干，获得L-草铵膦-N-羧酸酐。

9.如权利要求7所述L-草铵膦-N-羧酸酐的制备方法，其特征在于步骤(3)中产酶培养基组成为：乳糖10g/L，酵母膏12g/L，NaCl 10g/L，MgSO₄0.22g/L、KH₂PO₄0.136g/L，溶剂为水，pH 7.0。

10.一种权利要求1所述的L-草铵膦-N-羧酸酐在制备L-草铵膦中的应用，其特征在于所述的应用为：将所述的L-草铵膦-N-羧酸酐与质量浓度36-38％浓盐酸混合，加热回流，蒸干溶剂，向浓缩物中加入体积浓度95％的乙醇水溶液a，加热回流，在回流状态下，再每次加入2mL体积浓度95％的乙醇水溶液b，直到固体物质完全溶解，将反应液用冰水混合物冷却到30℃，加入环氧乙烷，5-10℃静置12小时，待结晶完全后，过滤，滤饼室温真空干燥，得L-草铵膦；所述L-草铵膦-N-羧酸酐与环氧乙烷投料物质的量之比为1:2-4，所述浓盐酸体积用量以L-草铵膦-N-羧酸酐物质的量计为6L/mol，所述95％的乙醇水溶液a的体积用量以L-草铵膦-N-羧酸酐物质的量计为1-3mL/mmol。