[发明专利]过滤载体及其应用

说明书

本发明提供一种用于筛选具有目标长度的寡聚核苷酸的过滤载体，其中所述过滤载体从5’至3’方向上包括启动子、报告基因和位于启动子与报告基因之间的至少一个酶切位点，其中所述具有目标长度的寡聚核苷酸在插入所述酶切位点之后不会导致针对所述报告基因的移码突变。本发明还提供所述过滤载体的构建方法及其在提高噬菌体或细菌基因文库的构建过程中所用的化学合成寡聚核苷酸的正确率中的应用。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地涉及一种用于化学合成的寡聚核苷酸质量检测及正确率提高的过滤载体。更具体地，本发明公开了一种用于筛选具有目标长度的寡聚核苷酸的过滤载体。本发明还提供所述过滤载体的构建方法及其在提高噬菌体或细菌基因文库的构建过程中所用的化学合成寡聚核苷酸的正确率中的应用。

背景技术

通过化学方法合成的寡聚核苷酸在生命科学的应用非常广泛，比如基因的人工合成,基因测序以及通过PCR方法的基因扩增等等。目前寡聚核苷酸的化学合成主要通过亚磷酰胺法(Phosphoramidite chemistry),每个合成周期包含4个化学反应：去封闭、连接、加保护基团和氧化(Kosuri et al (2014)Nature Methods 11:499-507)。尽管每个化学反应的效率都已经优化,达到98％以上，但每步化学反应都不可能是100％准确的,所以通过化学方法合成的寡聚核苷酸都包含有不同程度的错误序列,而且错误的比例随着寡聚核苷酸长度的增长而显著增加(Bauer et al(1989)Nucleic Acids Res.17:812Wosnick et al(1987)Gene 60:115-127)。通过各种合成后的纯化手段,比如OPC、PAGE或HPLC,合成的寡聚核苷酸纯度会有所提高,但它们不能完全消除错误。寡聚核苷酸供应商报告的错误率约为1/100到1/1000(Hecker et al(1998)BioTechniques 24:256-260)。

在所有通过化学方法合成的寡聚核苷酸的错误类型中，缺失一个或两个核苷酸(N-1、N-2)是最常见的(Hecker et al(1998)BioTechniques 24:256-260McClain et al(1986)Nucleic Acids Res.14:6770)。这些来源于不完全化学反应的产物也是最难以去除的,因为它们和正确产物的区别很小。当这些带有N-1和N-2类型错误的寡聚核苷酸被整合到开放阅读框(ORFs),它们会引入移码突变，导致非功能性基因产物的产生。如果一 个基因的合成或扩增只需要2条或几条寡聚核苷酸,而且通过下游的基因测序方法能够挑选出正确的序列,通常由单条寡聚核苷酸序列错误引起的问题不太严重。但是,当一个基因或其中的片段是由多条寡聚核苷酸拼接而成的时候,包含错误序列的比例会显著增加。比如,如果一条寡聚核苷酸的正确率为98％,那么由8条寡聚核苷酸组装而成的基因片段的正确率只有(0.98 6)85％。当这些带有错误序列的基因或片段被转化到噬菌体或细菌内时(比如在噬菌体或细菌基因文库的构建过程中),携带有包含错误序列基因的菌体通常比携带有包含正确序列基因的菌体有竞争优势,因为由正确序列编码的外源基因产物经常对菌体有毒性,因而抑制菌体的生长(Derda et al(2011)Molecules 16:1776-1803Knappik et al(2000)J.Mol.Biol.296:57-86Thomas et al(2010)Anal.Biochem.407(2):237-240)。因此提高正确基因序列的比例对高质量基因文库的构建是至关重要的。

发明内容

本发明提供了一种方法，用以检测化学合成的简并寡聚核苷酸的质量。同时也能有效地过滤掉不符合阅读框(out-of-frame)的寡聚核苷酸,从而增加简并寡聚核苷酸的正确率。这些质量得到提高了的寡聚核苷酸特别适合应用于各类基因文库的构建，构建的文库的全长基因正确率也因为寡聚核苷酸质量的提高而显著提高。