[发明专利]过滤载体及其应用

权利要求书

1.一种用于筛选具有目标长度的寡聚核苷酸的过滤载体，其中所述过滤载体从5’至3’方向上包括启动子、报告基因和位于启动子与报告基因之间的至少一个酶切位点，其中所述具有目标长度的寡聚核苷酸在插入所述酶切位点之后不会导致针对所述报告基因的移码突变，其中所述寡聚核苷酸是简并寡聚核苷酸，所述寡聚核苷酸用于构建基因文库，其中所述过滤载体是pFV02，其核苷酸序列如SEQ ID No:6所示。

2.一种构建过滤载体pFV02的方法，所述pFV02的核苷酸序列如SEQ ID No:6所示，所述方法包括以下步骤：

1)扩增氯霉素乙酰基转移酶基因；

2)在pUC19质粒的β-内酰胺酶基因两端插入AscI和NotI限制性内切酶位点，得到载体pUC19AN；

3)在β-内酰胺酶成熟肽和信号肽之间插入酶切位点及连接肽，构建质粒pUC19ANL；

4)将氯霉素乙酰基转移酶基因插入到上述构建的pUC19ANL质粒中，得到过滤载体pFV01；

5)通过定点突变的方法去除pFV01载体CAT基因内的两个PvuII酶切位点，得到的质粒为pFV01-2；和

6)在pFV01-02载体的β-内酰胺酶成熟肽和信号肽间插入SpeI和PvuII酶切位点以及连接序列,得到质粒pFV02。

3.一种用于筛选具有目标长度的寡聚核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：

1)设计并构建过滤载体，其中所述过滤载体从5’至3’方向上包括启动子、报告基因和位于启动子与报告基因之间的至少一个酶切位点，其中所述具有目标长度的寡聚核苷酸在插入所述酶切位点之后不会导致针对所述报告基因的移码突变，其中所述寡聚核苷酸是简并寡聚核苷酸，其用于构建基因文库；

2)将待检测的寡聚核苷酸通过PCR转换成双链DNA片段；

3)双链DNA片段经酶切后连接到步骤1)中所述的过滤载体中；

4)将连接产物转化到宿主细胞中；

5)通过所述报告基因筛选具有目标长度的寡聚核苷酸。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述过滤载体在所述启动子和所述酶切位点之间还包括信号肽编码基因，所述信号肽为所述报告基因编码的报告蛋白的信号肽。

5.根据权利要求4所述的方法，其中在所述信号肽编码基因和所述报告基因之间包括连接肽编码序列，所述连接肽在插入所述寡聚核苷酸的酶切位点之前。

6.根据权利要求5所述的方法，其中在所述启动子与报告基因之间具有至少两个酶切位点，在这至少两个酶切位点之间包含终止密码子。

7.根据权利要求6所述的，其中所述信号肽编码基因和所述报告基因处于所述启动子的控制之下并且两者的相对位置符合两者的阅读框。

8.根据权利要求3所述的方法，其中所述过滤载体还任选地包括选择基因，所述选择基因和所述报告基因彼此不同并且独立地选自抗生素抗性基因、荧光素酶基因、β半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、氨基酸合成基因和它们的组合，并且通过所述报告基因和/或选择基因和/或其组合筛选具有目标长度的寡聚核苷酸。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述报告基因是β内酰胺酶或其成熟肽基因，所述选择基因是氯霉素乙酰基转移酶基因。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述过滤载体是质粒载体，所述β内酰胺酶的成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，所述氯霉素乙酰基转移酶的氨基酸序列如SEQ IDNo:2所示。

11.根据权利要求5所述的方法，其中所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示，所述连接肽的编码序列如SEQ ID No:4所示。