[发明专利]一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法

说明书

技术领域

本发明属于种子质量检验技术领域，涉及杂交西瓜种子纯度检验的方法，特别是一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法。

背景技术

荃抗绿霸是由安徽荃银高科种业股份有限公司培育的高产优质杂交西瓜新品种(晋审西瓜2011006、甘认瓜2011005、皖品鉴登字第1001007)，具有优秀的田间农艺性状。该品种在杂交制种过程中,母本需要人工去雄，授以父本花粉来完成杂交过程，母本去雄不彻底或漏去雄，都将会极大地影响制种纯度。因此鉴定杂交西瓜种子纯度至关重要。

传统的西瓜杂交种子纯度鉴定工作仍然以田间种植鉴定为主，通过成株外观形状比较鉴定，该方法鉴定一般需要1至2个月，时间长、费用高、难度大且准确性差，需要鉴定人员具有丰富的经验，因此田间表型鉴定越来越不适宜现代农业的发展需要。室内纯度检验通常采用DNA鉴定技术，这是一种直接在DNA水平上进行基因组差异分析的技术，不受环境和人为因素影响；其中SSR技术是以PCR为基础发展起来的，具有信息含量高、准确率高、稳定性好、易于分析等特点，是西瓜杂种纯度鉴定的理想技术。高质量西瓜基因组序列图谱的完成为西瓜分子育种提供了基础条件，同时DNA快速提取法，具有快速、简便、可操作性强、实用性强的特点，非常适合西瓜杂交种品种纯度的鉴定。本研究利用荃抗绿霸与双亲在一些SSR位点上的差异，寻找合适的引物，用于西瓜杂交种室内纯度检测，为荃抗绿霸纯度鉴定提供一个准确、稳定、快捷、实用的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够对杂交西瓜荃抗绿霸种子纯度进行准确、稳定、简单快捷、省时省力的检测方法。

一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取西瓜杂交品种荃抗绿霸样品基因组DNA；

2)以西瓜杂交品种荃抗绿霸样品基因组的DNA为模板，选用SSR引物对进行PCR扩增；

所述的SSR引物序列为：

QYXG3F：5’-CCCTATTGCCCATTTTTCTCA-3’，

QYXG3R：5’-AAATTTGTGCTCTCCGTGGG-3’；

QYXG7F：5’-CATTGCCGTTTCCATTTTCTTCAC-3’，

QYXG7R：5’-GTAACATCCAGCAGTTCGCCAT-3’；

3)将步骤2)的扩增产物经8％的双垂直板非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，220V稳压电泳直至溴酚蓝指示剂迁移至可以使扩增DNA片段能够被清楚识别的距离时，停止电泳；银染法染色，拍照记录待测西瓜杂交品种荃抗绿霸样品DNA的特征谱带；

4)提取西瓜杂交品种荃抗绿霸父母本样品的基因组DNA，然后重复上述步骤2)-3)的方法，获得父母本样品DNA的特征谱带；

5)以父母本样品DNA的特征谱带作为对照，只有同时具有亲本特征谱带的单株才为真正的“荃抗绿霸”杂交种，缺少亲本任意一个特征谱带均被视为非杂交种；再采用下式计算受检样品的种子纯度：

受检样品的种子纯度(％)＝(供检样品株数－非杂交种株数)/供检样品株数×100。

所述的一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，其特征在于：步骤1)是采用快速提取法提取待测样品DNA。

所述的一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，其特征在于：步骤1)具体方法为：剪取西瓜杂交品种荃抗绿霸样品种子发芽3-4天后1cm左右的幼芽，装入2ml离心管，加入0.4M的NaOH溶液，用组织捣碎仪打碎样品，沸水水浴1min左右后加入pH 8.0的Tris-HCl缓冲液，充分混匀，得西瓜杂交品种荃抗绿霸样品DNA提取液即为待测西瓜杂交品种荃抗绿霸基因组DNA，4℃下保存备用。

所述的一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，其特征在于：

步骤2)包括以下步骤：在PCR反应板内加入西瓜杂交品种荃抗绿霸样品基因组DNA、含Mg²⁺的buffer、dNTPs、SSR引物、Taq酶和ddH₂O；先进行94℃下的预变性5min；接着以94℃下变性30sec、55℃退火30sec、72℃下延伸30sec为一个循环，进行35个循环反应；最后在72℃下延伸5min，反应完成后，加入Loading buffer终止反应，得西瓜杂交品种荃抗绿霸的扩增产物，4℃下保存备用。