[发明专利]一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法

权利要求书

1.一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）提取西瓜杂交品种荃抗绿霸样品基因组DNA；

2）以西瓜杂交品种荃抗绿霸样品基因组的DNA为模板，选用SSR引物对进行PCR扩增；

所述的SSR引物序列为：

QYXG3F ：5’-CCCTATTGCCCATTTTTCTCA-3’，

QYXG3R ：5’-AAATTTGTGCTCTCCGTGGG-3’；

QYXG7F ：5’-CATTGCCGTTTCCATTTTCTTCAC-3’，

QYXG7R：5’-GTAACATCCAGCAGTTCGCCAT-3’；

3）将步骤2）的扩增产物经8%的双垂直板非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，220 V稳压电泳直至溴酚蓝指示剂迁移至可以使扩增DNA片段能够被清楚识别的距离时，停止电泳；银染法染色，拍照记录待测西瓜杂交品种荃抗绿霸样品DNA的特征谱带；

4) 提取西瓜杂交品种荃抗绿霸父母本样品的基因组DNA，然后重复上述步骤 2）-3）的方法，获得父母本样品DNA的特征谱带；

5）以父母本样品DNA的特征谱带作为对照，只有同时具有亲本特征谱带的单株才为真正的“荃抗绿霸”杂交种，缺少亲本任意一个特征谱带均被视为非杂交种；再采用下式计算受检样品的种子纯度：

受检样品的种子纯度（%）＝（供检样品株数－非杂交种株数）/供检样品株数×100。

2.根据权利要求1所述的一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，其特征在于：步骤1）是采用快速提取法提取待测样品DNA。

3.根据权利要求2所述的一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，其特征在于：步骤1）具体方法为：剪取西瓜杂交品种荃抗绿霸样品种子发芽3-4天后1 cm左右的幼芽，装入2 ml离心管，加入0.4 M的NaOH溶液，用组织捣碎仪打碎样品，沸水水浴1 min左右后加入pH 8.0的Tris-HCl缓冲液，充分混匀，得西瓜杂交品种荃抗绿霸样品DNA提取液即为待测西瓜杂交品种荃抗绿霸基因组DNA，4℃下保存备用。

4.根据权利要求1所述的一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，其特征在于：

步骤2）包括以下步骤：在PCR 反应板内加入西瓜杂交品种荃抗绿霸样品基因组DNA、含Mg²⁺的buffer、dNTPs、SSR引物、Taq酶和ddH₂O；先进行94℃下的预变性5 min；接着以94℃下变性30 sec、55℃退火30 sec、72℃下延伸30 sec为一个循环，进行35个循环反应；最后在72℃下延伸5 min，反应完成后，加入Loading buffer终止反应，得西瓜杂交品种荃抗绿霸的扩增产物，4℃下保存备用。

5.根据权利要求1所述的一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，其特征在于：步骤2）中，所述的西瓜杂交品种荃抗绿霸样品基因组DNA浓度为10-50 ng/μl、含Mg²⁺的buffer为含Mg²⁺的10×buffer、dNTPs浓度为2.5 mM、SSR引物浓度为2 μM、Taq酶浓度为5 U/μl；所述的10-50 ng/μl西瓜杂交品种荃抗绿霸样品基因组DNA、含Mg²⁺的10×buffer、2.5 mM dNTPs、2 μM SSR引物、5 U/μl Taq 酶和ddH₂O 的体积比为：2∶1.5∶1∶2∶0.2∶3.3。

6.根据权利要求3所述的一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，其特征在于：步骤1）中，NaOH 溶液与Tris-HCl溶液的体积比为1:1。

7.根据权利要求1所述的一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法，其特征在于：步骤3）中，所述浓度为8%的聚丙烯酰胺溶液由20 ml ddH₂O、4 ml 10×TBE、16 ml 20% Acr-Bis、40 μl TEMED、400 μl 10% AP配制而成。