[发明专利]猪血白细胞抗菌肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于抗菌肽的提取方法，具体涉及一种猪血白细胞抗菌肽的制备方法。

背景技术

抗菌肽具有广谱、高效的抗微生物活性，还能促进动物生长，诱导动物的获得性免疫。而且其独特的抗菌机理不会使微生物产生耐药性，在机体内无残留，具有良好的应用开发前景，抗菌肽的应用可能会带来一场抗微生物战略的新革命。

目前，我国生猪屠宰加工产业迅速发展，我国年生猪出栏6亿头，猪血资源非常丰富，但利用率低，不超过10％，如被加工成血粉作为饲料添加剂，用于生化制药中血红素的生产，这些产品附加值低，而大多数作为废弃物直接排出，造成了资源浪费和环境污染。有关研究确认，猪血中具有较强抗菌活性的多肽，因此开发研究一种从猪血中提取、纯化抗菌肽的成熟方法，可以一举多得。而目前在国内外还未见有从猪血白细胞提取抗菌肽的技术方法和产品。

发明内容

为了克服现有技术领域存在的上述问题，本发明的目的在于，提供一种猪血白细胞抗

菌肽的制备方法，解决目前国内没有从猪血白细胞中提取抗菌肽的技术方法和产品的问题。

本发明提供的猪血白细胞抗菌肽的提取方法，它包括以下具体步骤：

（1）猪血采集：从屠宰场采集新鲜猪血加入10%的抗凝剂，充分混匀后用200目滤布过滤，除去纤维和血凝块及其他杂质；

（2）收集白细胞：将收集的抗凝猪血在4℃下高速离心，弃去大部分的上层黄色澄清血浆和底层红细胞，收集中间层即白细胞与血小板和部分血浆与红细胞沉淀。按3：1的比例加入0.83％氯化铵溶液裂解红细胞，搅拌30min后，4℃下高速离心，弃去上清液，收集沉淀即为白细胞；

（3）萃取：将白细胞中加入10％的醋酸，用料理机进行搅打破碎，染色镜检白细胞是否破碎，若未破碎，重复进行均质破碎，至镜检无完整细胞。4℃超高速离心，收集上清液即为中性粒细胞胞浆内的颗粒组份。4℃下搅拌过夜，萃取得醋酸提取物；

（4）脱酸：将以上方法萃取得到的醋酸提取物，经4℃下高速离心，收集上清液，旋转蒸发除去醋酸和部分水分后，真空冷冻干燥得抗菌肽粗品，密封包装后在-20℃保存。

（5）抗菌肽的纯化：将冻干抗菌肽粗品用0.5%甲醇溶解,再上样于层析柱，同时打开柱的下端出口，收集特征峰洗脱液再真空冷冻干燥得抗菌肽，-20℃保存；

所述步骤（1）中，抗凝剂是10%柠檬酸钠。

所述步骤（2）中，高速离心是3000r／min离心15min。

所述步骤（2）中，氯化铵溶液是0.83％氯化铵溶液。

所述步骤（3）中，超高速离心是 11000r／min离心40min。

所述步骤（4）中，旋转蒸发是指55℃旋转蒸发30min。

所述步骤（5）中，层析柱是葡聚糖凝胶SephadexG25。

所述步骤（5）中，特征峰洗脱液是指在280nm处有吸收峰的洗脱液。

所述的提取方法中，真空冷冻干燥得温度为-50--60℃，冷冻干燥的时间为24h-48h。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明提供的猪血白细胞抗菌肽的提取方法，进行详细的说明。

实施例

参照本实施例的猪血白细胞抗菌肽的提取方法，它包括以下具体步骤

1）猪血采集：从屠宰场采集新鲜猪血5L加入抗凝剂10%柠檬酸钠溶液500ml，充分混匀后用200目滤布过滤，除去纤维和血凝块及其他杂质；

2）收集白细胞：将收集的抗凝猪血在4℃下 3000r／min离心15min，弃去大部分的上层黄色澄清血浆和底层红细胞，收集中间层即白细胞与血小板和部分血浆与红细胞沉淀。按3：1的比例加入0.83％氯化铵溶液裂解红细胞，缓慢搅拌30min后，4℃下3000r／min离心15min，弃去上清液，收集沉淀即为白细胞，约150g左右；

3）萃取：将白细胞中加入15g醋酸，用料理机进行搅打破碎，染色镜检白细胞是否破碎，若未破碎，重复进行均质破碎，至镜检无完整细胞。4℃11000r／min离心40min，收集上清液即为中性粒细胞胞浆内的颗粒组份。4℃下搅拌过夜，萃取得醋酸提取物；

4）脱酸：将以上方法萃取得到的醋酸提取物，经4℃下 11000r／min离心40min，收集上清液，并于55℃旋转蒸发30min除去醋酸和部分水分后，-80℃真空冷冻干燥得抗菌肽粗品，密封包装后在一20℃保存；