[发明专利]一种基于二茂铁-氧化亚铜立方纳米框架标记的免疫传感器的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明一种基于二茂铁-氧化亚铜立方纳米框架标记的免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用二茂铁功能化的氧化亚铜立方纳米框架，制备一种检测甲胎蛋白的电化学免疫传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。

背景技术

甲胎蛋白是一种糖蛋白，正常情况下，这种蛋白主要来自胚胎的肝细胞，但当肝细胞发生癌变时，会产生大量甲胎蛋白，而且随着病情恶化，甲胎蛋白在血清中的含量会急剧增加，甲胎蛋白就成了诊断原发性肝癌的一个特异性临床指标，因此对甲胎蛋白的早期诊断很重要。目前已有的甲胎蛋白的临床检测方法很多，如放射免疫分析、酶联免疫分析、化学发光免疫分析等。电化学免疫传感器是将免疫学方法与电化学方法相结合的一种生物传感器，利用抗原与抗体之间的特性性结合，使得它具有高灵敏性、高选择性、分析快速和操作简便等优点。因此本发明制备了一种基于二茂铁-氧化亚铜立方纳米框架标记的免疫传感器，实现了对甲胎蛋白的检测。

本发明利用氧化亚铜立方纳米框架具有良好的电化学催化性能，将其氨基化后，通过氨基和羧基之间的相互作用，将二茂铁甲酸连接到氧化亚铜立方纳米框架的内部和外部，增加了二茂铁的负载量，得到的二茂铁功能化的氧化亚铜立方纳米框架实现了对双氧水的双重信号放大。在检测甲胎蛋白的过程中产生了逐步放大的电化学信号，有效地增强了电化学免疫传感器的灵敏度。该方法具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且制备过程较为简单，为目前有效检测甲胎蛋白提供了新途径。

发明内容

本发明的目的之一是基于二茂铁功能化的氧化亚铜立方纳米框架，构建了一种无酶、快速且超灵敏的夹心型电化学免疫传感器。

本发明的目的之二是将该夹心型电化学免疫传感器应用于甲胎蛋白的检测。

本发明的技术方案如下：

1. 一种基于二茂铁-氧化亚铜立方纳米框架标记的免疫传感器的制备方法

（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干，在电极表面滴加6 μL、1~3 mg/mL的三氨丙基三乙氧基硅烷功能化的石墨烯水溶液，干燥；

（2）继续将6 μL浓度为8 ~ 12 μg/mL的甲胎蛋白捕获抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；

（3）用3 μL浓度为5 ~ 15 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；

（4）将6 μL浓度为0.000005 ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的甲胎蛋白用于和捕获抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净；

（5）将6 μL浓度为1 ~ 3 mg/mL的二茂铁-氧化亚铜立方纳米框架标记的甲胎蛋白检测抗体溶液滴在电极上与抗原特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。

二茂铁-氧化亚铜立方纳米框架标记的甲胎蛋白检测抗体溶液的制备

（1）氧化亚铜立方纳米框架的制备

首先，将8.32 ~ 16.64 mL超纯水、0.50 ~ 1.00 mL浓度为0.1 mmol/L的氯化铜溶液和0.087 ~ 0.174 g十二烷基硫酸钠在持续搅拌下混合，将装有该混合液的玻璃瓶放在温度为32~34℃的水浴中，当十二烷基硫酸钠粉末完全溶解后，加入0.18 ~ 0.36 mL浓度为1.0 mmol/L 的氢氧化钠溶液，该溶液立刻变为明亮的蓝色，表明生成了氢氧化铜沉淀，然后，在1 s内将0.92 ~1.84 mL浓度为0.1 mmol/L的盐酸羟胺溶液立刻注入玻璃瓶，搅拌20 s，在几秒钟之内溶液立即从亮蓝色变成了绿色，最后， 加入0.08 ~ 0.16 mL浓度为1.0 mmol/L的盐酸溶液，继续搅拌20 s，在几秒钟之内溶液的颜色由绿色变为黄色，溶液的全部体积为10 ~ 20 mL，将该溶液在水浴中老化1 h用于纳米晶体的生长，将3 ~ 6 mL体积分数为95%的乙醇加入到溶液中，静置1 h后超声1 min，清晰的淡黄色变为絮状，将该样品在5000 rpm下离心3 min，去除顶层溶液，沉淀用10 ~ 20 mL体积比为1:1的水和乙醇清洗，最后用5 ~ 10 mL的乙醇清洗，离心后干燥;

（2）二茂铁-氧化亚铜立方纳米框架标记的甲胎蛋白检测抗体溶液的制备