[发明专利]一种用于饲用屎肠球菌冻干制剂的保护剂及制备方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种用于饲用屎肠球菌真空冷冻干燥处理的保护剂及冻干制剂的制备方法。

背景技术

真空冷冻干燥是一种实现活性乳酸菌长期保藏的常用的、有效的方法。但是，在冷冻干燥过程中，乳酸菌细胞会受到各种各样的损伤，主要包括冰晶体的形成，细胞膜受到机械破坏，细胞膜渗透压的改变，胞内失水，溶质浓度升高，产生溶质效应，敏感蛋白变性和失活，水分的损失影响到细胞内许多亲水性大分子物质的功能，此外，还会导致细胞内外pH的动态平衡被破坏，甚至出现DNA的损伤，这些损伤必然造成冷冻干燥过程中细胞存活率的损失。为了减少真空冷冻干燥处理对乳酸菌细胞造成的损失，提高冻干存活率，必须采取各种有效的措施对乳酸菌加以保护。

各种保护措施中，最有效的是使用冻干保护剂。通常来说，用于乳酸菌真空冷冻干燥的保护剂主要分为3类：一、可以渗透进入细胞壁和细胞膜的保护剂，称为渗透保护剂(例如一些单糖、二糖和甘油等)；二、只能渗透进入细胞壁，不能进入细胞膜的保护剂，也可以称为半渗透保护剂(例如一些寡糖、氨基酸和低分子聚合物)；三、无法渗透进入细胞壁，或者不能直接和细胞表面作用的保护剂(例如高分子聚合物和多糖等)。不同类型保护剂对细胞产生的保护作用不尽相同：渗透保护剂可以增强细胞膜的可塑性，进入细胞质后易与溶液中的水分发生水合作用，减少细胞过度脱水，降低溶质的毒性作用，减缓冰晶的形成，从细胞内部实现保护作用；半渗透保护剂聚集于细胞膜和细胞壁之间，可以在冷冻前诱导细胞的胞浆分离，而且能够在细胞膜和细胞壁之间形成缓冲带，阻止冰晶带来的机械伤害，从而保护了细胞膜及内部的结构；非渗透保护剂无法进入细胞内部，只能吸附于细胞表面，形成粘滞层，阻止冰晶的形成速度，从细胞外部实现保护作用。很多报道表明，上述3类保护剂中任何一类保护剂的单独使用都很难实现理想的保护效果，只有将3类保护剂复合使用才能实现理想的保护。除冻干保护剂外，菌悬液的预冻条件、菌泥与保护剂的混合比例、冻干制剂的贮藏条件等因素也会影响到乳酸菌冻干过程的存活率。

目前市售冻干乳酸菌制剂的活菌数大多在2×10¹¹-5×10¹¹CFU/g的范围，极少有超过5×10¹¹CFU/g的水平，而且其中大部分产品属于人用产品，将真空冷冻干燥的方法用于生产饲用乳酸菌活菌制剂的研究和应用都比较少，原因主要是成本较高，冻干制剂的贮藏条件较严格，而且目前该工艺主要用于乳酸杆菌，很少针对乳球菌开发出优良的冻干制剂。因此，开发一种用于饲用乳球菌真空冷冻干燥处理的低成本、高产量、耐贮藏的冻干保护剂和冻干工艺是十分有意义的。

发明内容

(一)发明目的：

本发明针对上述不足，提供了一种用于屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCCNo.7746真空冷冻干燥处理的保护剂和冻干制剂的制备方法，从而减少真空冷冻干燥处理对屎肠球菌带来的损伤，获得低成本、高活菌数、耐贮藏的屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCC No.7746冻干制剂。

(二)技术方案：

本发明的目的通过如下方案获得实现：

1.本发明提供了一种用于屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCC No.7746真空冷冻干燥的保护剂，其成分及含量(质量百分比)如下：脱脂奶粉5-15％、山梨醇1-3％，甘氨酸0.02-0.2％，低聚半乳糖0.2-2％，麦芽糖0.2-2％，其余成分为蒸馏水。配制方法如下：称取50-150g脱脂奶粉，10-30g山梨醇，2-20g低聚半乳糖和2-20g麦芽糖溶于蒸馏水中，定容至990mL，115℃灭菌20min；称取2-20g甘氨酸溶于蒸馏水中，定容至100mL，过滤除菌后，取10mL加入到上述灭菌的保护剂溶液中，混合后待用(下同)。

2.本发明提供的保护剂与菌泥的混合比例为：每克菌泥与3-5mL保护剂混合。

3.本发明提供的屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCC No.7746冻干制剂的制备方法如下：

(1)高密度发酵后的屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCC No.7746经管式离心机在10000-15000rpm条件下离心收集菌体。

(2)将保护剂与收集的菌泥混合后置于匀浆机中，2800rpm匀浆5min。