[发明专利]遗传性血管水肿的检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种遗传性血管水肿的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂 盒包括：包被抗人C1-INH抗体的载体、生物素标记的C1-INH校准品、 链霉亲和素偶联的辣根过氧化酶试剂、化学发光底物液A和B以及洗 涤液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述载体为化学 发光板或磁珠微粒。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述抗人 C1-INH抗体选自鼠抗人C1-INH单克隆抗体、兔抗人C1-INH多克隆抗 体、羊抗人C1-INH的多克隆抗体、鸡抗人C1-INH多克隆抗体中的一 种或多种。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述抗人C1-INH 抗体选自鼠抗人C1-INH单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述鼠抗人 C1-INH单克隆抗体的纯度不小于95％，浓度不小于1mg/mL。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述抗人C1-INH 抗体浓度为5μg/mL。

7.权利要求1-6任一项所述的试剂盒的制备方法，其特征在于： 包括以下步骤：

(1)包被抗人C1-INH抗体的载体的制备：

包被抗人C1INH抗体的96孔化学发光板：将包被用抗人C1-INH 抗体加至碳酸盐缓冲液中混匀，加入微孔板内，每孔100μL，包被浓 度1～5μg/mL，4℃过夜，用含Tween20的磷酸盐缓冲液洗涤微孔板 2遍后，再加入含有BSA的磷酸盐缓冲液，室温静置2小时后，弃 去孔内液体，彻底干燥发光板，于铝箔袋真空包装，放2-8℃保存；

或包被抗人C1-INH抗体的磁珠微粒：将直径0.15μm的磁珠微 粒用戊二醛活化，室温混匀2～5小时候，用0.01mol/LPBS缓冲液 冲洗4次，并将该溶液进行悬浮，浓度为0.1mg/mL～2.5mg/mL；然 后，每毫升悬液中加入抗人C1-INH抗体10μg，于20～40℃混匀孵 育3～10小时；用等体积的0.01MPBS2％～5％BSApH7.0～7.4缓冲 液于20～40℃孵育2～8小时；最后，用2％BSA0.01～0.1MTris-HCl pH7.5～pH9.0缓冲液清洗三次，并用该溶液配制成磁珠微粒浓度 0.1～1.0mg/mL，即得；

(2)生物素标记的C1-INH校准品的制备：将C1-INH用0.1 mol/L，pH8.0的碳酸氢钠缓冲液或0.5mol/L，pH8.6的硼酸缓冲液 稀释到1mg/mL，并用0.1mol/L，pH8.0的碳酸氢钠缓冲液或0.5 mol/L，pH8.6的硼酸缓冲液，对蛋白质充分透析；用1mLDMSO溶 解NHSB1mg；向1mLC1-INH溶液加入120μlNHSB溶液；在室温 下持续搅拌，保温2-4小时；加入9.6μL1mol/LNH₄Cl，在室温下搅 拌10分钟；在4℃，对PBS充分透析，以除去游离的生物素；将样 品上1mL的分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集1mL/管，蛋白质在 1-3mL之间洗下；最后，样品加入叠氮钠及1.0g/LBSA.将结合产物 置4℃，避光保存；

(3)链霉亲和素偶联的辣根过氧化酶试剂的制备：将链霉亲和 素偶联的辣根过氧化酶用2％BSA，0.01MTris-HClpH7.4的缓冲液配 制为0.5ug～1ug/mL。

8.权利要求1-6任一项所述的试剂盒的应用，其特征在于，所述 应用的具体方法为：

1)将浓度分别为0U/mL、0.125U/mL、0.375U/mL、0.65U/mL、 1.0U/mL、1.25U/mL、1.6U/mL的C1-INH校准品各100μL依次加入 到微孔板中，然后将50μL患者血清加入微孔中，然后加入50μL生 物标记的C1-INH，室温或37℃孵育15min～45min；

2)孵育结束后，洗板5次；

3)加入100μL链霉亲和素偶联的辣根过氧化酶试剂，室温或 37℃孵育15min～30min；

4)孵育结束后，洗板5次；

5)加入化学发光底物A液和底物B液各50μL，5min后读数；

6)建立校准品曲线，将样本检测孔化学发光值代入校准品曲线， 计算出样本中的C1-INH的含量；

或为：

1)在校准品检测管中加入50μL磁珠微粒试剂，加入50μL校准 品；在样本检测管中加入50μL磁珠微粒试剂，然后加入25μL血清 样本，再加入25μL生物素标记的C1-INH校准品，37℃孵育5～15min；

2)将孵育后的检测管在磁场中分离，去除上清液，经洗液多次 清洗后，取出磁场，震荡使磁珠微粒充分混悬；

3)向步骤2中的检测管中加入100μL链霉亲和素偶联的辣根过 氧化酶试剂，37℃孵育5～15min；

4)将孵育后的检测管在磁场中分离，去除上清液，经洗液多次 清洗后，取出磁场，震荡使磁珠微粒充分混悬；

5)添加磁场，使步骤4)处理后的磁珠微粒在磁场中分离，去 除上清液，然后加入发光底物A和底物B，取出磁场，充分混匀厚茧 检测5min内相对发光强度值。