[发明专利]一种维生素B12在线免疫亲和净化柱及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属于维生素检测技术领域，特别是涉及一种维生素B12在线免疫亲和净化柱及其使用方法。

背景技术

目前，免疫亲和层析是一种利用抗原抗体特异性可逆结合特性的SPE技术,根据抗原抗体的高选择性,从复杂的待测样品中提取目标化合物。它具有高选择性及高亲和性，目前，在真菌毒素、兽药残留、微量维生素分析中作为前处理净化手段应用越来越广泛。但是由于商品化的免疫亲和净化柱只能使用一次，且价格较高，阻碍了其在实际检测工作的使用。现有的检测方法存在检测成本高，手工操作，检测时间长，检测效率低等技术问题。

发明内容

本发明为解决公知技术中存在的技术问题而提供一种B12在线免疫亲和净化柱及其使用方法。

本发明提供一种B12在线免疫亲和净化柱，该净化色谱柱不仅能重复使用，而且通过与液相色谱或液相色谱-串联质谱的联用，实现样品的净化、分析的自动化。

本发明能在线、重复使用，可净化维生素B12。将该免疫亲和净化柱通过阀切换连接到具有双泵的液相色谱仪或液相色谱-串联质谱仪上，通过上样、转移和分析与平衡等步骤实现维生素B12的在线免疫亲和净化测定。

本发明的目的之一是提供一种具有免疫亲和净化柱可以多次使用，降低检测费用，缩短了检测时间，简化了检测步骤等特点的B12在线免疫亲和柱。

本发明B12在线免疫亲和净化柱所采取的技术方案是：

一种B12在线免疫亲和净化柱，其特点是：免疫亲和柱中装填偶联有B12抗体的琼脂糖凝胶，两端有密封筛板。

本发明B12在线免疫亲和净化柱还可以采用如下技术方案：

所述的B12在线免疫亲和净化柱，其特点是：免疫亲和柱为圆柱形不锈钢填充柱，圆柱形不锈钢填充柱直径为2－6mm，长度为20－30mm。

所述的B12在线免疫亲和净化柱，其特点是：圆柱形不锈钢填充柱装有双液相泵的液相色谱仪或液相色谱-串联质谱仪及连接阀。

所述的B12在线免疫亲和净化柱，其特点是：双液相泵为净化泵和洗脱泵，净化泵为免疫亲和柱输送液体，洗脱泵为分析柱输送液体。

本发明的目的之二是提供一种具有操作方便，降低检测费用，手动净化方式改为自动净化，节省了人力，缩短了检测时间，简化了检测步骤，检测效率高等特点的B12在线免疫亲和净化柱的使用方法。

本发明B12在线免疫亲和净化柱的使用方法所采取的技术方案是：

一种B12在线免疫亲和净化柱的使用方法，其特征是：B12在线免疫亲和净化柱一端连接净化泵，另一端连接六通阀，洗脱泵与六通阀连通，六通阀连通分析柱，分析柱连接检测仪，切换六通阀实现免疫亲和净化柱与分析柱的串联或并联；其使用过程包括以下步骤：

(1)上样：六通阀使免疫亲和净化柱与分析柱独立，净化泵提供磷酸盐缓冲液，含有B12的样品提取液被带入免疫亲和，B12被吸附，杂质被吸附而随上样液进入废液；分析柱处于初始流动相平衡阶段；

(2)转移：通过六通阀切换，免疫亲和净化柱与分析柱串联使用，净化泵提供乙腈/水，免疫亲和柱上富集的B12随洗脱液进入分析柱；

(3)分析与平衡：免疫亲和净化柱通过净化泵依次提供的乙腈、磷酸盐缓冲液进行冲洗与平衡，为下一个样品分析做准备；分析柱通过洗脱泵提供的梯度洗脱溶液，将B12分离并带入检测仪，实现B12的检测。

本发明B12在线免疫亲和净化柱的使用方法还可以采用如下技术方案：

所述的B12在线免疫亲和净化柱的使用方法，其特点是：检测仪为液相色谱检测仪或串联质谱检测仪。

所述的B12在线免疫亲和净化柱的使用方法，其特点是：上样及平衡溶液为pH 7.2至pH 7.6的磷酸盐缓冲液，流速1.8－2.2mL/min。

所述的B12在线免疫亲和净化柱的使用方法，其特点是：转移溶剂为体积比为1：1的乙腈/水，转移流速0.4－0.8mL/min，转移时间3－5min。

所述的B12在线免疫亲和净化柱的使用方法，其特点是：分析柱为4.6mm*100mm粒径为3μm的C18填料的色谱柱，操作条件采用甲醇-0.1％甲酸水溶液梯度洗脱，流速为0.5－0.7mL/min。

本发明具有的优点和积极效果是：