[发明专利]一种维生素B12在线免疫亲和净化柱及其使用方法

权利要求书

1.一种维生素B12在线免疫亲和净化柱，其特征是：免疫亲和净化柱中装填偶联有  B12抗体的琼脂糖凝胶，两端有密封筛板。

2. 根据权利要求1所述的B12在线免疫亲和净化柱，其特征是：免疫亲和净化柱为圆柱 形不锈钢填充柱，圆柱形不锈钢填充柱直径为2－6mm,长度为20－30mm。

3.根据权利要求2所述的B12在线免疫亲和净化柱，其特征是：圆柱形不锈钢填充柱装有双液相泵的液相色谱仪或液相色谱-串联质谱仪及连接阀。

4.根据权利要求3所述的B12在线免疫亲和净化柱，其特征是：双液相泵为净化泵和洗脱泵，净化泵为免疫亲和柱输送液体，洗脱泵为分析柱输送液体。

5.根据权利要求1所述的B12在线免疫亲和净化柱的使用方法，其特征是：B12在线免疫亲和净化柱一端连接净化泵，另一端连接六通阀，洗脱泵与六通阀连通，六通阀连通分析柱，分析柱连接检测仪，切换六通阀实现免疫亲和净化柱与分析柱的串联或并联；其使用过程包括以下步骤：

上样：六通阀使免疫亲和净化柱与分析柱独立，净化泵提供磷酸盐缓冲液，含有B12的样品提取液被带入免疫亲和净化柱，B12被吸附，杂质被吸附而随上样液进入废液；分析柱处于初始流动相平衡阶段；

转移：通过六通阀切换，免疫亲和净化柱与分析柱串联使用，净化泵提供乙腈/水，免疫亲和谱柱上富集的B12随洗脱液进入分析柱；

分析与平衡：免疫亲和净化柱通过净化泵依次提供的乙腈、磷酸盐缓冲液进行冲洗与平衡，为下一个样品分析做准备；分析柱通过洗脱泵提供的梯度洗脱溶液，将B12分离并带入检测仪，实现B12的检测。

6.根据权利要求5所述的B12在线免疫亲和净化柱的使用方法，其特征是：检测仪为液相色谱检测仪或串联质谱检测仪。

7.根据权利要求5所述的B12在线免疫亲和净化柱的使用方法，其特征是：上样及平衡溶液为pH 7.2至pH 7.6的磷酸盐缓冲液，流速1.8－2.2 mL/min。

8.根据权利要求5所述的B12在线免疫亲和净化柱的使用方法，其特征是：转移溶剂为体积比为1：1的乙腈/水，转移流速0.4－0.8mL/min，转移时间3－5 min。

9.根据权利要求5所述的B12在线免疫亲和净化柱的使用方法，其特征是：分析柱为4.6mm*100mm粒径为3μm的C18填料的色谱柱，操作条件采用甲醇-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱，流速为0.5－0.7 mL/min。