[发明专利]一种检测SLC26A4基因突变的试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体地说涉及用于检测耳聋相关基因SLC26A4IVS7-2A>G突变的试剂盒及其应用。

背景技术

溶质转运蛋白家族26,成员4(solute carrier family 26,member 4；SLC26A4)基因定位于7q31，编码离子转运相关蛋白，对SO₄^2-，HCO^3-，I^-，Cl^-等多种单价或二价离子进行转运，在机体离子成分平衡的维持中发挥重要作用。内耳具有复杂而精细的液体平衡系统，因此任何致病性的基因突变都会导致内耳离子成分和渗透压的改变，从而对人的听觉和身体平衡产生重要影响。SLC26A4纯合或杂合突变是大前庭水管综合征明确的致病原因。

该基因突变在中国聋哑人群中的发病率约8-12％。该基因可以有数以百计的突变形式，但中国聋哑人群中常见致病突变为SLC26A4基因IVS7-2A＞G，该突变筛查为纯合突变或复合杂合突变者时，意为发现了患儿耳聋的遗传致病因素，可以通过预防感冒，避免颅脑外伤、剧烈运动等防止听力波动和防止聋哑的发生，并进行定期检测，对发现听力下降者给与早期干预和治疗。

目前针对单核苷酸多态性(Single-nucleotide polymorphism，SNP)基因突变检测的方法有数十种，如基因芯片法、荧光定量PCR法、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)法和金标准PCR产物直接测序法等，但这些方法普遍存在技术要求高、仪器设备要求高、成本高等特点，因此在基层使用具有一定局限性。迫切需要一种简便、快速检测SLC26A4IVS7-2A>G突变的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测SLC26A4基因突变的试剂盒及其应用。

四引物扩增受阻突变体系PCR法(Tetras-primer amplification refractory mutationsystem-PCR，四引物ARMS-PCR)其基本原理是：针对一个SNP位点设计2个延伸方向相反的内侧引物(Inner primer)，2个引物的3’末端碱基分别与SNP位点的1个碱基相同(或互补)，并引入错配碱基增加引物的特异性，然后按正常的方法设计2个方向相反的外引物(Outer primer)；用这4个引物链组成的3对引物在1个PCR反应中进行扩增(巢式PCR)；扩增产物用凝胶电泳检测，出现2条带的是纯合型，出现3条带的是杂合型。

本发明根据四引物扩增受阻突变体系PCR技术原理，针对SLC26A4基因IVS7(-2)位点A>G突变设计出一组特异引物，正常外引物序列如SEQ ID NO.1所示，突变外引物序列如SEQ ID NO.2所示，正常内引物序列如SEQ ID NO.3所示，突变内引物序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供用于检测的引物组合，其特征在于，包括以下四条引物：

正常外引物S-1：5‘-CATATGAGAATTGATTGTGTGTGTGTGC-3’(SEQ ID NO.1)

突变外引物S-2：5‘-TGTTTCTTCCAGATCACACACAAATAGG-3’(SEQ ID NO.2)

正常内引物S-3：5‘-ATGAAATGGCAGTAGCAATTATCGGCT-3’(SEQ ID NO.3)

突变内引物S-4：5‘-GGAGTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTCCG-3’(SEQ ID NO.4)。

本发明提供了上述引物组合在检测SLC26A4基因突变中的应用。

本发明还提供了上述引物组合在制备SLC26A4基因突变检测试剂盒中的应用。

含有上述引物组合的试剂盒也属于本发明的保护范围。

可以将本发明引物以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。因此含有上述引物组合的试剂盒也属于本发明的保护范围。

本发明的试剂盒可以是由多个隔断所形成，以容纳固定一个或多个如管或小瓶的容器。这些容器之一或者多个可以装有本发明的引物，根据需要该引物可以是冻干形式或溶于缓冲液中的状态。另外，本发明的试剂盒中还可以包括用于PCR反应的一种或多种酶/试剂，以及实施本发明所需要的其它成分及用具。

进一步地，本发明试剂盒的工作程序为，当总体系为20μL时，如下：