[发明专利]检测犬细小病毒IgG抗体的ELISA试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明为检测犬细小病毒IgG抗体的检测试剂盒，属于生物技术领域。具体而言，本发明涉及一种犬细小传染性疾病中检测抗体的ELISA试剂盒及其制备方法。

背景技术

犬细小病毒(canine parvo virus，CPV)属细小病毒科，细小病毒属。健康犬经消化道感染病毒后，病毒主要攻击两种细胞，一种是肠上皮细胞，一种是心肌细胞，分别表现胃肠道症状和心肌炎症状。CPV主要感染犬，尤其是幼犬，传染性极强，死亡率很高。病犬是主要传染源，呕吐物、唾液、粪便中均有大量病毒。

细小病毒是一种无囊膜，单链的DNA病毒。P45蛋白为细小病毒结构蛋白之一，研究表明具有较好的免疫原性。

发明内容

本发明公开了一种检测犬细小病毒IgG抗体的基于间接ELISA方法的试剂盒及其制备方法，可用于犬细小病毒IgG抗体的大量筛查。

本发明还提供了一种P45基因载体构建、蛋白的表达及纯化的工艺。

本发明还提供了一种兔抗犬IgG多克隆抗体的制备工艺及辣根过氧化物酶标记方法。

本发明的目的是以原核表达的重组蛋白为基础，通过酶联免疫技术研制一种检测犬细小病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于检测犬细小病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒，所述的试剂盒包括由辣根过氧化物酶标记的兔抗犬IgG多克隆抗体。

还包括ELISA板条、血清稀释液和浓缩洗涤液、底物显色液、终止液、酶标单克隆抗体、阳性对照、阴性对照。

上述用于检测犬细小病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒包括：

所述ELISA板条：每个试剂盒装有1块ELISA微孔板，每块ELISA板条为能自行拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板，包被抗原为原核表达的P45，规格为8孔×12条；

所述血清稀释液和浓缩洗涤液：血清稀释液为即用型，洗涤液为25倍浓缩，使用前稀释；

所述底物显色液：即用型TMB显色液，10mL；

所述终止液：2mol/L的H₂SO₄溶液，10mL；

所述酶标多克隆抗体：所述辣根过氧化物酶标记的兔抗犬IgG多克隆抗体，使用前100倍稀释；

所述阳性对照为：经高温灭活的经疫苗免疫后犬血清稀释液。

所述阴性对照为：经高温灭活的未患病且未经疫苗免疫的犬血清稀释液。

所述的间接ELISA试剂盒在检测犬细小病毒IgG抗体中的应用。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

本发明的技术方案如下：

一、抗原制备

1.犬细小病毒P45的表达

根据GenBank中瘟热病毒P45基因序列，设计合成了1对引物，采用PCR方法从DNA中扩增出P45基因片段，将其克隆到表达载体pET28b中，构建了重组质粒pET-P45，测序验证后转化入表达宿主菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达。

2.犬细小病毒P45的纯化

诱导结束后，离心收集诱导后菌体，用PBS洗涤重悬菌体，超声裂解(超声1s，间隔1s，共10min)，12000rpm离心，分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析。蛋白纯化时使用镍离子亲和层析柱，纯化后，经SDS-PAGE、western blotting鉴定，获取到单一条带，并具备较好的抗原性。使用BCA法测定纯化后蛋白含量，纯化后P45的OD值为1.65，与标准品比较后，其浓度为1000μg/ml。

二、辣根过氧化物酶标记兔抗犬IgG的制备

1.纯化犬IgG的制备

取经检验合格的犬作为采血用犬，采血前体况较好，体温、食欲、大小便正常，无其他疾病。消毒后，颈静脉采血，分离血清，纯化IgG方案为辛酸-硫酸铵沉淀法。