[发明专利]一种从酿酒酵母中提取纯化SOD的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取纯化SOD的方法，尤其涉及一种从酿酒酵母中提取纯化SOD的方法。

背景技术

O₂^-·称为超氧阴离子自由基，是生物体多种生理反应中自然生成的中间产物。超氧阴离子既是阴离子又是自由基，既是氧化剂，又是还原剂。现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。在体内，超氧阴离子主要通过超氧歧化酶清除。

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)在生物界的分布极广，几乎从动物到植物，甚至从人到单细胞生物，都有它的存在。SOD是生物体内重要的抗氧化酶，具有特殊的生理活性，是生物体内清除超氧阴离子的首要酶。SOD催化如下的反应：

2O₂^-+2H⁺→H₂O₂+O₂

SOD通过上述反应可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧，但体内的过氧化氢酶和过氧化物酶会立即将其分解为完全无害的水。

超氧化物歧化酶根据其活性中心所含金属辅基不同可分为三种，第一种是含铜（Cu）锌（Zn）金属辅基，称（Cu-Zn型SOD），这是最为常见的一种SOD，呈绿色或蓝色，主要存在于细胞质中；第二种是是含锰（Mn）金属辅基的称（Mn型SOD），存在于真核细胞的线粒体和一些原核细胞内；第三种是含铁（Fe）金属辅基的称（Fe型SOD），呈黄褐色，存在于原核细胞中。

目前，应用最广泛的是Cu-Zn型SOD。SOD是生物体内氧自由基的天然清除剂，具有广泛的医用价值，可作为药品、食品及日化产品的添加剂。例如SOD对一些由于年龄、疾病或伤害造成的组织硬化以及纤维化显示出较强的再生修复能力。SOD也已被成功地应用于放疗后的辅助治疗、贝切特氏症的治疗、控制心脏病人的进展、严重的风湿性关节炎的治疗等领域。

目前，国内外商品化的SOD主要从动物的血液（例如猪血或牛血）或者肝脏中提取得来，然而一些人畜共患病的原因使得许多国家禁止在食品、化妆品、医疗等领域使用动物来源的SOD。因此，从植物和微生物中提取SOD成为了人们的主要研究方向。然而植物来源的SOD存在含量低、比活低、纯化过程复杂等缺陷，而用微生物生产SOD除了不存在上述缺陷之外，还存在生长速率快的优势，因此微生物逐渐成为SOD的主要的来源。例如，专利号为2011100503115报道了一种用酿酒酵母生产重组人源SOD的方法，但是这个专利集中在重组酿酒酵母的构建，并未公开SOD纯化方法，而从细胞内获取SOD时更是采用超声法，不适合大规模工业化生产；专利号为201310103919.9报道了一种酿酒酵母菌株及其在制备耐热超氧化物歧化酶中的应用，这项专利主要集中在酿酒酵母菌种的筛选以及发酵上，对于SOD的纯化并未深入研究；专利号为2011103369936的专利中，公布了一种从酿酒酵母中同时提取S-腺苷-L-甲硫氨酸和SOD的方法，然而这种方法纯化的SOD纯度较低，而且在破壁时采用有机溶剂法，纯化时也采用丙酮沉淀法，这对于环境有一定的污染，也使得SOD酶活有一定得损失；专利号为200810061168.8的专利中，报道了从重组酿酒酵母中提取耐高温超氧化物歧化酶的方法，然而这种方法需要用80℃水浴，这会使得酿酒酵母中SOD失活，此外该专利需要用有机溶剂——乙醇沉淀，这对酿酒酵母SOD的酶活也有损害，最后透析也会影响工艺工业化时的放大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单、可实现工业化大生产的从酿酒酵母中提取纯化SOD的方法，并且所提取纯化的SOD具有较高活性。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明从酿酒酵母中提取纯化SOD的方法包括下述操作步骤：

1）菌体收集：用板框过滤器收集湿酿酒酵母细胞；

2）菌体匀浆：将上述酿酒酵母细胞中加入2~30倍体积的水，搅拌使酿酒酵母均匀分散为悬浮液，用高压均质机在300~1500bar匀浆2~8次；

3）粗酶液制备：向匀浆后产物加入pH7~9的聚醚酰亚胺溶液，使聚醚酰亚胺的终浓度为1~25g/L；搅拌均匀后加入硅藻土，硅藻土的加入量为每升100~300克；混合均匀后用板框过滤器过滤收集滤液，即为SOD粗酶液；

或将匀浆后产物以10000~16000rpm离心，上清液用陶瓷膜微滤系统过滤得到SOD粗酶液；