[发明专利]米诺地尔人工抗原、其多克隆抗体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种米诺地尔人工抗原、其多克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

米诺地尔是一种治疗高血压的血管扩张药，局部长期使用时可刺激毛发增生。1988年美国FDA批准米诺地尔可外用治疗男性雄激素性脱发。虽然米诺地尔只是局部外用,但存在头皮轻度皮炎、眩晕、刺激性过敏、面部和四肢多毛症等不良反应,使用不慎可能会灼伤和刺激眼部。日用洗发护发类化妆品不允许添加该药物，《化妆品卫生规范》(2007)明令禁止在化妆品中添加米诺地尔。但一些生产商为使洗发护发类化妆品达到一定功效，牟取利润，违规添加米诺地尔。因此，有必要对洗发护发类化妆品中是否含有米诺地尔及其盐和衍生物进行检测。

近年来，食品中农药、兽药残留、保健品和化妆品中的非法添加剂的检测方法已成为研究热点，其中，以小分子为待测物的免疫分析技术发展迅速。免疫分析是以抗原与抗体的特异性结合反应为基础的新型分析技术。相对于传统检测方法，它具有简便、快速、灵敏度高和成本低廉、便于现场检测和高度特异性等特点。此外，免疫分析技术对药品鉴定、药物代谢研究、药材中农药和重金属残留的检验、解毒及环境监测等也具有重要意义。

免疫分析几乎适用于所有生物活性物质的检测，其基本原理是以待测物合成人工抗原，经动物获取相应的单克隆抗体，然后建立和优化免疫分析程序进行检测。有效的人工抗原的合成是保证免疫分析的前提和关键，其合成途径一般为:先根据待测分子的结构设计合成具有活性基团的半抗原，然后依据免疫学原理选择适当的载体，最后用适当的方式将半抗原与载体相互耦联，形成载体-半抗原结合物，纯化后即得到人工抗原。

最近几年，对于人工抗原的合成国内外已有较多报道，Tuomola等用一个分子量很小的化合物(分子量为131.2)3-甲基吲哚的羰基与适当较长的连接臂连接,合成9个半抗原,通过进一步筛选实验得到特异性单克隆抗体。

虽然人工抗原的合成方法有了很大的发展，但是所得到人工抗原的免疫原性差异较大，部分人工抗原不能完全满足免疫分析的要求。由于免疫应答具有其复杂性，对于一个具体的待测物，其人工抗原的合成要根据自身结构特征具体分析与对待，需要设计、组合出多套方案，如从不同位置引入不同性质的基团、不同长度的间隔臂，将半抗原与多种载体相结合，通过改变投料比例获得不同结合比的人工抗原等等。通过免疫活性测试，优化筛选制备方案。因此，人工抗原合成研究不单纯是化学合成问题，亦涉及免疫学原理，如何根据免疫学原理合成具有较高免疫原性的人工抗原是该领域的重要研究方向。

目前国内仍未有明确关于洗发护发类化妆品中米诺地尔及其盐和衍生物的检测方法标准。有文献报道用紫外分光光度计和高效液相色谱法测定米诺地尔洗剂和血浆中的米诺地尔，但这两种方法灵敏度差、不具有特异性。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有良好免疫原性的米诺地尔人工抗原、其多克隆抗体及其制备方法和应用。解决当前没有高灵敏度、高特异性的米诺地尔及其盐和衍生物的检测方法的问题。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种米诺地尔人工抗原，其结构式为：

一种米诺地尔人工抗原的制备方法，包括如下步骤：

(1)取米诺地尔(Minoxidil)，溶于甲醇中，再加水稀释，即得溶液Ⅰ；

(2)取蛋白载体，溶于pH值为7.2-7.4的缓冲溶液中，即得溶液Ⅱ；

(3)取25％的戊二醛(GA)，加水稀释40～50倍，即得溶液Ⅲ；

(4)量取溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ，其中溶液Ⅰ和溶液Ⅲ的摩尔浓度比为50～100:1，将溶液Ⅰ和溶液Ⅲ混合均匀，混合后溶液逐滴加入到溶液Ⅱ中，溶液Ⅰ和溶液Ⅲ的混合液与溶液Ⅱ的体积比为1～2:5，搅拌8-12小时；

(5)将(4)中搅拌后的混合溶液装入透析袋中，对水透析4-5天，每天更换2-3次透析液，收集透析外液，即得米诺地尔人工抗原；

优选地，所述蛋白载体为牛血清白蛋白(BSA)；

优选地，所述溶液Ⅰ和溶液Ⅲ的摩尔浓度比为80:1；

一种米诺地尔人工抗原的多克隆抗体，是能与所述米诺地尔人工抗原发生特异性免疫反应的免疫球蛋白；

一种米诺地尔人工抗原多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

(2)将制备好的米诺地尔人工抗原作为免疫原，对小鼠进行注射；

(2)第一次免疫注射后，每隔2周注射一次，即加强免疫；