[发明专利]一种产软骨素的重组枯草芽孢杆菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种产软骨素的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

软骨素(chondroitin)为糖胺聚糖(GAG)的多糖家族。糖胺聚糖是一类由重复的二糖单元组成的无支链的、带负电荷的多糖链，由于其独特的非柔性的性质和高的负电荷，GAG表现出高度延展的构象，占用大量空间，吸收阳离子和水并在细胞外基质中形成多孔的凝胶，在大多数动物中被发现的GAG帮助水合和扩展组织，并使基质能够承受压力(compressive force)。因此，糖胺聚糖组成了一类具有巨大治疗应用潜力的化合物。软骨素一种构为4-GlcA-β-1,3-GalNAc-β-1(GlcUA:葡糖醛酸，GalNAc:乙酰半乳糖胺)二糖单体以β-1,3键交替连接而成的聚多糖。硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)，是软骨素糖链生成后由磺基转移酶在GalNAc的碳4位或碳6位进行硫酸化。根据其化学组成和结构差异可分为A、B、C、D、E、F、H等多种，通常从哺乳动物组织中提取得到的硫酸软骨素以CS-A、CS-C为主。一般硫酸软骨素约含有50-70个双糖单位，分子量在10000-50000道尔顿之间。

硫酸软骨素是一类重要的生物高分子，具有广泛的生物活性，具有多种药理作用与生理功能。研究发现硫酸软骨素具有抗动脉粥样硬化作用，镇痛抗炎作用，促进成骨细胞增生，诱导新骨形成；抗肿瘤作用，免疫调节作用，抗氧化、清除自由基和廷缓衰老的作用，还具有抗炎、抗病毒、抗过敏和加速伤口愈合的作用，如抗HIV活性。随着对硫酸软骨素生理功能及生化性质的深入研究，在欧、美、日等发达国家，硫酸软骨素作为流行的保健品长期应，用于防治冠心病、心绞痛、心肌梗塞、冠状动脉机能不全、心肌缺血等疾病，无明显的毒副作用，能显著降低冠心病患者的发病率和死亡率，也做为膳食补充用于保护关节。

硫酸软骨素主要存在于动物的软骨组织中，硫酸软骨素的工业化生产主要是采用酶法与碱法相结合等传统的提取工艺，从气管、鼻中隔、鸡龙骨及鲨鱼软骨等动物软组织中提取硫酸软骨素。传统的提取方法造成软骨素的收率低，成本较高，且碱解产生的大量工业废水易对环境产生较大影响。同时，原材料的短缺和下游纯化工艺的复杂程度限制了该活性成分的全球利用度，因此市场受限于不能满足不断增长的需求。而且，从长远来看，由于不断颁布对动物来源药物的安全性日益严格的管理条例，动物组织提取获得的硫酸软骨素可能将被限制在生药市场之外。为此，采用安全有效的方法制备硫酸软骨素已成为需要首要解决的问题。这就迫切需求人们开始寻求新的替代途径。

根据软骨素的结构和细胞合成代谢途径，以微生物发酵合成软骨素及其衍生物的研究成为近几年的研究热点。通过培养微生物细胞而获得大量的软骨素是最具经济效益和开发潜力的生产工艺。发酵法生产软骨素的优点体现在：1)不受原料限制，微生物培养成本低，生产强度大；2)工艺条件温和；3)产品质量稳定安全；4)环境友好、无污染等。

自然界中许多真菌和细菌等微生物均能合成低聚合度的软骨素或其类似物，目前研究发现能产软骨素的微生物主要集中在巴斯德杆菌Pasteurella multocida、大肠杆菌Escherichia coli K4。但作为工业生产菌株需具备：1)人畜安全；2)能利用廉价的糖质原料；3)生长迅速，发酵周期短；4)遗传背景清楚；5)能大量合成软骨素或其类似物等条件。由于上述菌株都存在一定的致病性及大肠杆菌产内毒素及热源物质等，不能满足现在的食品医疗安全要求。

本发明应用食品安全级的枯草芽孢杆菌发酵生产软骨素。本发明通过基因重组技术，完善了枯草芽孢杆菌代谢合成软骨素的途径，并且对软骨素的两个前体物质的合成途径进行模块化调控表达，进而引起胞内两个前体物UDP-Gal-NAc和UDP-GlcA浓度的变化，最终引起软骨素产量的变化该发明操作过程简单，易于实现工业化大规模生产制备软骨素。

发明内容

本发明提供了一种产软骨素的重组枯草芽孢杆菌，是在枯草芽孢杆菌中导入UDP-N-乙酰氨基葡糖C4异构酶和软骨素合成酶，构建枯草芽孢杆菌代谢合成软骨素的途径。

所述重组枯草芽孢杆菌，还可以以模块化组装调控方式，分别对胞内软骨素的两个前体物UDP-N-乙酰氨基葡糖(UDP-GlcNAc)和UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)的合成途径的基因进行调控，提高软骨素产量。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 168。