[发明专利]一种用于检测肺孢子虫的引物、探针和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于检测肺孢子虫的引物、探针和试剂盒。

背景技术

肺孢子虫(Pneumocystis)是一种呈世界性分布的机会致病性病原体，肺孢子虫最早发现于豚鼠体内。肺孢子虫作为致病性病原体，可以引起严重的肺部疾患称肺孢子虫肺炎(Pnuemocystis Pneumonia，PCP)。

现有技术中常采用环介导恒温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)检测肺孢子虫，环介导恒温扩增是一种新的核酸扩增方法，采用环介导恒温扩增法检测肺孢子虫的过程，试剂容易被污染，因此，在操作时需要非常规范，即便规范操作有时也可能会引起污染，大大降低了检测的成功率。

发明内容

为了解决现有技术中检测肺孢子虫成功率低的问题，本发明实施例提供了一种用于检测肺孢子虫的引物、探针和试剂盒。所述技术方案如下：

一方面，本发明实施例提供了一种用于检测肺孢子虫的引物和探针，所述引物和探针包括：用于检测肺孢子虫的正向引物、用于检测肺孢子虫的反向引物和用于检测肺孢子虫的探针，其中，

所述用于检测肺孢子虫的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；

所述用于检测肺孢子虫的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；

所述用于检测肺孢子虫的探针如序列表中SEQ ID NO.3所示；

所述探针的5’端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，所述探针的3’端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。

另一方面，本发明实施例提供了一种用于检测肺孢子虫的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物和探针。

具体地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反应液、临界阳性质控品、阳性质控品、阴性质控品和工作标准品。

具体地，所述核酸释放剂包括无菌水、终浓度为0.03-0.3％的聚乙二醇辛基苯基醚、终浓度为0.04-0.4％的壬基酚聚氧乙烯(40)醚和pH值为8.3的终浓度为0.01-0.1M的三(羟甲基)氨基甲烷。

具体地，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中包括：终浓度为0.01U/μL～0.05U/μL的Taq酶、终浓度为0.2～0.6mM的dNTPs、10×PCR缓冲液和终浓度为1.5～5.0mM的含Mg离子的溶液。

具体地，所述临界阳性质控品包括含浓度为1.0×10⁴拷贝/mL的肺孢子虫基因片段的溶液。

具体地，所述引物的终浓度为0.05-0.9μM，所述探针的终浓度为0.05-0.9μM。

具体地，所述工作标准品包括：工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3和工作标准品4，其中，

所述工作标准品1为含有1.0×10⁷拷贝/mL的肺孢子虫基因的非传染性DNA片段；

所述工作标准品2为含有1.0×10⁶拷贝/mL的肺孢子虫基因的非传染性DNA片段；

所述工作标准品3为含有1.0×10⁵拷贝/mL的肺孢子虫基因的非传染性DNA片段；

所述工作标准品4为含有1.0×10⁴拷贝/mL的肺孢子虫基因的非传染性DNA片段。

具体地，，所述阳性质控品包括含浓度为1.0×10⁶拷贝/mL的肺孢子虫基因片段的溶液。

具体地，所述阴性质控品为浓度0.8％生理盐水。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的用于检测肺孢子虫的引物和探针，具有灵敏度高的特性，使得本发明实施例提供的用于检测肺孢子虫的试剂盒，具有灵敏度高的特性，采用仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，其检测结果可靠，提高了检测的灵敏度，即使仅存在单拷贝的目的片段该试剂盒也可以进行有效的检测；检测速度快，整个检测过程共仅需2～3小时。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例2提供的荧光扩增曲线图；