[发明专利]一种DC细胞与CIK细胞的共培养方法

说明书

技术领域

一种DC细胞与CIK细胞的共培养方法，属于细胞培养技术领域。

背景技术

CIK生物免疫治疗作为21世纪治疗肿瘤的首选方案，广泛用于各种实体瘤的治疗。CIK生物免疫治疗具备：1）增殖，可以在短时间内大量扩增；2）CIK细胞来源于自身对人体没有任何毒副作用；3）杀瘤谱广，对绝大多数肿瘤都具备杀伤效力；4）杀瘤活性高，且不受CSA、FK506等免疫抑制剂的影响；5）可有效抵抗肿瘤细胞引发的凋亡机制。树突状细胞,简称DC细胞, 是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，增殖细胞毒性T淋巴细胞CTL，从而介导强大的特异性抗肿瘤细胞免疫。

DC细胞是机体免疫应答的始动者，能够诱导持久有力的特异性抗肿瘤免疫反应；CIK细胞可通过非特异性免疫杀伤作用清除肿瘤患者体内微小残余病灶，所以负载肿瘤抗原的DC与CIK的有机结合,即DC-CIK细胞,能产生特异性和非特异性的双重抗肿瘤效应。DC细胞与CIK细胞共培养后，提高了细胞的增殖速度和杀伤活性，且使其对肿瘤细胞的杀伤作用更具特异性。然而，现有的DC-CIK共培养，是将收获的DC细胞添加到CIK培养体系中，从而通过DC细胞与CIK细胞的结合，将DC细胞携带的抗原信息提成给CIK细胞；但是CIK的培养环境不利于DC细胞的生长，不能有效的长时间维持DC细胞的活性，从而影响DC细胞提呈抗原的效率。DC细胞成熟慢、生存期短，CIK细胞的扩增培养时间较长，两种细胞共培养后存在培养时间不同步的问题，导致所获的DC-CIK细胞活性降低。目前迫切需要一种可延长DC细胞生存期的DC-CIK共培养方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种DC细胞与CIK细胞的共培养方法，该方法可明显延长DC细胞的生存期，长时间保持DC细胞的活性。

本发明的技术方案为，该DC细胞与CIK细胞的共培养方法，由如下步骤组成： 1）提取单个核细胞、2）CIK细胞培养、3）DC细胞培养、4）DC细胞和CIK细胞混合培养、5）扩增培养；

其中，步骤4）DC细胞和CIK细胞混合培养具体操作如下：

4.1）将培养瓶中的DC培养基混匀后，转移至无菌离心管；然后向培养瓶中加入10ml经4 ℃预冷的生理盐水，晃动培养瓶，并用10ml 移液管吹打瓶底的细胞，完毕后将培养瓶内液体移至无菌离心管，最终在离心管中得到用生理盐水悬浮的DC细胞，即DC细胞悬液；

4.2）将收集好的DC细胞悬液在离心机内，室温条件下离心10~20分钟；离心，弃上清液，继续用生理盐水重悬细胞，获得一次重悬细胞液，并对一次重悬细胞液进行取样计数；

4.3）从层流室的4℃冰箱中取出培养基，静置待培养基恢复至37℃；将步骤4.2）重悬细胞液进行离心，离心后弃上清液，用10ml  培养基重悬细胞，获得二次重悬细胞液，并对二次重悬细胞液进行取样计数；

4.4）吸取1.0×106个DC细胞、1.0×108个CIK细胞，在添加有培养基的培养体系中混合培养，培养体系为50ml ；按照50 ~100ng/ml的浓度向培养体系中补加2500 ng~5000ng的因子GM-CSF，然后置于37℃、体积分数5~6% 的CO₂培养箱继续培养；培养12小时后，再次添加2500ng~5000ng的因子GM-CSF，置于37℃、体积分数5~6% 的CO₂培养箱继续培养。

优选的，所述步骤1）提取细胞采用如下操作：

1.1）转移外周血：采集患者50~80ml 外周血，并转移到无菌离心管中，平均每管20~40ml  ；

1.2）铺层加样：将血样与生理盐水按1：1的体积比混合均匀，并缓慢加入盛有室温的5~20ml 人淋巴细胞分离液的无菌离心管中，配平后进行离心； 

1.3）提取单个核细胞：离心完毕后，离心管内出现分层，吸取血浆生理盐水层弃之，直至距白膜层5毫米处；将红细胞层之上的所有液体转移至无菌离心管中，按细胞悬液与生理盐水体积比1：1向无菌离心管中补充生理盐水，混匀；

1.4）洗涤Ⅰ：将步骤1.3）无菌离心管中所得的细胞进行离心，弃上清液，用生理盐水重悬细胞，混匀；

1.5）洗涤Ⅱ：将所得细胞收集到一支离心管中，加生理盐水至50ml ，充分混匀，离心，弃上清液；

1.6）洗涤Ⅲ：将所得细胞收集到一支离心管中，补生理盐水至40ml ，充分混匀，取样计数，离心，弃上清液，即得提取获得外周血单个核细胞。