[发明专利]一种DC细胞与CIK细胞的共培养方法

权利要求书

1.DC细胞与CIK细胞的共培养方法，其特征在于，由如下步骤组成： 1）提取单个核细胞、2）CIK细胞培养、3）DC细胞培养、4）DC细胞和CIK细胞混合培养、5）扩增培养；

其中，步骤4）DC细胞和CIK细胞混合培养具体操作如下：

4.1）将培养瓶中的DC培养基混匀后，转移至无菌离心管；然后向培养瓶中加入10ml经4 ℃预冷的生理盐水，晃动培养瓶，并用10ml 移液管吹打瓶底的细胞，完毕后将培养瓶内液体移至无菌离心管，最终在离心管中得到用生理盐水悬浮的DC细胞，即DC细胞悬液；

4.2）将收集好的DC细胞悬液在离心机内，室温条件下离心10~20分钟；离心，弃上清液，继续用生理盐水重悬细胞，获得一次重悬细胞液，并对一次重悬细胞液进行取样计数；

4.3）从层流室的4℃冰箱中取出培养基，静置待培养基恢复至37℃；将步骤4.2）重悬细胞液进行离心，离心后弃上清液，用10ml  培养基重悬细胞，获得二次重悬细胞液，并对二次重悬细胞液进行取样计数；

4.4）吸取1.0×106个DC细胞、1.0×108个CIK细胞，在添加有培养基的培养体系中混合培养，培养体系为50ml ；按照50 ~100ng/ml的浓度向培养体系中补加2500 ng~5000ng的因子GM-CSF，然后置于37℃、体积分数5~6% 的CO₂培养箱继续培养；培养12小时后，再次添加2500 ng~5000ng的因子GM-CSF，置于37℃、体积分数5~6% 的CO₂培养箱继续培养。

2.根据权利要求1所述的DC细胞与CIK细胞的共培养方法，其特征在于：所述步骤1）提取细胞采用如下操作：

1.1）转移外周血：采集患者50~80ml 外周血，并转移到无菌离心管中，平均每管20~40ml  ；

1.2）铺层加样：将血样与生理盐水按1：1的体积比混合均匀，并缓慢加入盛有室温的5~20ml 人淋巴细胞分离液的无菌离心管中，配平后进行离心； 

1.3）提取单个核细胞：离心完毕后，离心管内出现分层，吸取血浆生理盐水层弃之，直至距白膜层5毫米处；将红细胞层之上的所有液体转移至无菌离心管中，按细胞悬液与生理盐水体积比为1：1向无菌离心管中补充生理盐水，混匀；

1.4）洗涤Ⅰ：将步骤1.3）无菌离心管中所得的细胞进行离心，弃上清液，用生理盐水重悬细胞，混匀；

1.5）洗涤Ⅱ：将所得细胞收集到一支离心管中，加生理盐水至50ml ，充分混匀，离心，弃上清液；

1.6）洗涤Ⅲ：将所得细胞收集到一支离心管中，补生理盐水至40ml ，充分混匀，取样计数，离心，弃上清液，即得提取获得外周血单个核细胞。

3.根据权利要求1所述的DC细胞与CIK细胞的共培养方法，其特征在于：所述步骤2）CIK细胞培养具体操作如下：

2.1）接种细胞：使用培养基，将外周血单个核细胞的密度调整到4.0×10⁶～6.0×10⁶个/ml，接种至培养瓶中，置于37℃、体积分数5~6% 的CO₂培养箱继续培养1~2小时；

2.2）单核细胞分离：取出培养瓶，摇晃多次使沉降于底部的悬浮细胞浮起，将培养基转至无菌离心管中，再缓慢往瓶中加入10ml 培养基，晃动洗涤多次，并收集残留非贴壁细胞于无菌离心管中；

2.3）向步骤2.2）培养瓶中加入25~30ml  培养基，补充因子GM-CSF、因子IL-4，置于37℃，体积分数5% 的CO₂培养箱继续培养，所得细胞为DC前体细胞；

2.4）将收集到的DC前体细胞取样计数，用培养基调整细胞密度至1.0～2.0×10⁶/ml 接种到培养瓶中，加入因子IFN-γ混匀，置于37℃、体积分数5~6% 的CO₂培养箱继续培养；

2.5）上述悬浮细胞在经过24小时的培养后，向培养瓶中加入因子IL-2、IL-1α、抗CD3单抗，此后所培养的细胞即为CIK细胞。