[发明专利]使用编码靶向核酸内切酶附着体载体的基因组编辑方法及试剂盒

说明书

发明领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种基因组编辑方法及试剂盒。

背景技术

基因组编辑技术（genome editing）是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。这种技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。DNA修复系统主要通过两种途径修复DNA双链断裂,即非同源末端连接和同源重组。通过这两种修复途径，基因组编辑技术可以实现三种基因组改造的目的，即基因敲除，特异突变的引入和定点转基因。1）基因敲除：如果想使某个基因的功能丧失，可以在这个基因上产生DNA双链断裂，非同源末端连接修复的过程中往往会产生DNA的插入或删除，造成移码突变，从而实现基因敲除；2）特异突变引入：如果想把某个特异的突变引入到基因组上，需要通过同源重组来实现，这时候要提供一个含有特异突变同源模版。正常情况下同源重组效率非常低，而在这个位点产生双链断裂会极大的提高重组效率，从而实现特异突变的引入；3）定点转基因：与特异突变引入的原理一样，在同源模版中间加入一个转基因，这个转基因在双链断裂修复过程中会被拷贝到基因组中，从而实现定点转基因。

目前比较流行的基因组编辑技术包括锌指酶技术(zinc finger nuclease, ZFN) 、转录激活物样效应物核酸酶技术(Transcription activator–like effector nuclease，TALEN)和规律成簇间隔短回文重复技术(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR/Cas9)。

锌指酶（ZFN）由一个 DNA 识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。DNA 识别域是由3-4个 Cys2-His2锌指蛋白串联组成，每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。多个锌指蛋白串联起来形成一个锌指蛋白组识别一段特异的碱基序列（9-12 bp），具有很强的特异性。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI的C端的DNA剪切域，它在二聚体状态时才有酶切活性。每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，当两个识别位点相距恰当的距离时（6-8 bp），两个单体ZFN相互作用产生酶切功能。从而达到 DNA 定点剪切的目的。

TALEN技术是在ZFN技术之后发展起来的一种分子生物学工具。Boch和Moscou等人发现来自植物细菌Xanthomonassp.的TALE蛋白核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有固定的对应关系。TALE的核酸识别单位为重复34个恒定氨基酸序列，其中的12、13位点双连氨基酸与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NG识别T，HD识别C，NI识别A，NN识别G。把这4种TAL模块组装起来就可以特异结合任意的DNA序列。Cermak等用TALE模块代替ZFN中的DNA识别域，组装成新的基因组编辑工具即TALEN （Tal effector nuclease），实现了靶向基因组编辑的目的。

CRISPR/Cas9是最新出现的一种由RNA指导的Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。CRISPR/Cas9是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。在这一系统中，crRNA（CRISPR-derived RNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点切断双链DNA。在基因组编辑过程中，tracrRNA和crRNA可以融合成为1条RNA（sgRNA，本发明中称之为向导RNA）表达同样可以起到靶向剪切的作用。CRISPR/Cas9的优点是操作简单，对基因组的效率高。需要对某一个靶位点编辑的时候，只需要表达相应的向导RNA即可，不需要对Cas9核酸酶进行改造。但是最近的研究表明CRISPR/Cas9系统存在一定的脱靶剪切现象，阻碍了这种技术的广泛应用。为了克服脱靶剪切现象，麻省理工学院脑与认知科学助理教授、McGovern 脑研究所和Broad研究所核心成员Feng Zhang等人利用一种突变的只在DNA上面产生单切口的内切酶Cas9n（Cas9-D10A）和两个识别位点较近的向导RNA同时在细胞中表达，Cas9n分别切开DNA的两个链产生DNA断裂，这就提高了特异性。