[发明专利]使用编码靶向核酸内切酶附着体载体的基因组编辑方法及试剂盒

权利要求书

1.一种用于修饰细胞的基因组编辑方法，其特征在于具体步骤为：

首先，构建一个附着体载体编码靶向核酸内切酶和筛选基因；

然后，将所述附着体载体导入到细胞中，在药物的筛选下培养细胞若干天，使所有的细胞中都含有附着体载体并稳定表达靶向核酸内切酶。

2.根据权利要求1 所述的基因组编辑方法，其特征在于所述附着体载体是病毒附着型载体： EBV、BKV、BPV-1或 SV40，或者是非病毒附着型载体： S/MAR；这类DNA载体的共同特征是能够在真核细胞中复制扩增。

3.根据权利要求1或2 所述的基因组编辑方法，其特征在于所述靶向核酸内切酶是锌指核酸酶、大范围核酸酶、转录激活物样效应物核酸酶或者规律成簇间隔短回文重复CRISPR/Cas9。

4.根据权利要求3所述的基因组编辑方法，其特征在于所述靶向核酸内切酶在特定位置切断DNA，细胞的DNA修复系统通过非同源末端连接修复法或者同源重组修复法修复DNA断裂。

5.根据权利要求1 所述的基因组编辑方法，其特征在于所述细胞是培养的细胞、原代细胞、永生细胞、干细胞、诱导的多潜能干细胞 或单细胞胚。

6.根据权利要求1 所述的基因组编辑方法，其特征在于所述细胞是人细胞、哺乳动物细胞、脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞或单细胞真核生物。

7.根据权利要求6 所述的基因组编辑方法，其特征在于所述哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢细胞、由SV40 转化的猴肾CVI 系、人胚肾系293、幼仓鼠肾细胞、小鼠Sertoli 细胞、猴肾细胞、非洲绿猴肾细胞、人宫颈癌细胞、犬肾细胞、buffalo 大鼠肝细胞、人肺细胞、人肝细胞、小鼠乳腺瘤细胞、大鼠肝瘤细胞、HIH/3T3 细胞、人U2-OS 骨肉瘤细胞、人A549 细胞、人K562 细胞、人HEK293 细胞、人HEK293T 细胞、人HCT116 细胞、人MCF-7 细胞和TRI 细胞。

8.根据权利要求3 所述的基因组编辑方法，其特征在于所述附着体载体 EBV系统，为如下几种质粒之一种：EBNA1 Cas9eGFP、EBNA1 Cas9copGFP、EBNA1 Cas9TK、EBNA1 Cas9nTK；其中： 

（一）EBNA1 Cas9eGFP 附着体载体，含有：hSpCas9内切酶，向导RNA表达系统，包括：hU6启动子、后面的骨架RNA 和它们之间的gRNA插入位点即SapI位点，嘌呤霉素，绿色荧光蛋白eGFP、质粒在真核细胞中复制的元件EBNA1和EBV oriP，在大肠杆菌中扩增质粒用的氨苄抗性基因（Amp）和复制起始点pUC origin；

（二）EBNA1 Cas9copGFP 附着体载体，含有：hSpCas9内切酶，向导RNA表达系统，包括：hU6启动子、后面的骨架RNA 和它们之间的gRNA插入位点即SapI位点，嘌呤霉素、荧光蛋白copGFP，质粒在真核细胞中复制的元件EBNA1和EBV oriP，在大肠杆菌中扩增质粒用的氨苄抗性基因（Amp）和复制起始点pUC origin；

（三）EBNA1 Cas9TK 附着体载体，含有：hSpCas9内切酶，向导RNA表达系统：hU6启动子gRNA插入位点即SapI位点、后面的骨架RNA，嘌呤霉素和1型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶HSV1-tk的融合蛋白（purotk）、质粒在真核细胞中复制的元件EBNA1和EBV oriP，在大肠杆菌中扩增质粒用的氨苄抗性基因（Amp）和复制起始点pUC origin；

（四）EBNA1 Cas9nTK 附着体载体，含有：hSpCas9内切酶的突变体hSpCas9n，向导RNA表达系统：hU6启动子gRNA插入位点即SapI位点、后面的骨架RNA，嘌呤霉素和1型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶HSV1-tk的融合蛋白（purotk），质粒在真核细胞中复制的元件EBNA1和EBV oriP，在大肠杆菌中扩增质粒用的氨苄抗性基因（Amp）和复制起始点pUC origin。