[发明专利]一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于免疫分析与生物传感技术领域，具体涉及一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器的制备及应用，研制一种快速检测猪瘟病毒抗原CSFV的夹心型电化学免疫传感器。

背景技术

猪瘟病毒抗原CSFV，或称猪霍乱，是一种急性、热性、高度接触性传染病，主要特征是高温、微血管变性而引起全身出血、坏死、梗塞。由于其高度的致病性和可引起广泛的死亡，给养猪业造成严重的经济损失。许多国家制定兽医法规，将猪瘟病毒列为法定传染病之一，也就是必须列表上报的疾病。发生疫情或可疑疫情，要尽快上报，立刻对疫点及其邻近牧场采取紧急兽医卫生防疫措施。

目前国内外绝大多数检测机构都在使用酶联免疫法对猪瘟病毒抗原CSFV进行检测。由于其检测周期长，程序复杂所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学生物化学，分子生物学的不断发展，电化学免疫传感器已经引起广泛的研究兴趣。

本发明采用夹心型电化学免疫传感器，结合双重放大技术，提高了传感器的检测灵敏度，另外，电化学免疫传感器以其选择性好、结构简单、操作简便、易于小型化、可连续、快速自动化检测分析等优点，可以被广泛的应用预防检测当中。

发明内容

本发明的目的在于避免传统检测方法的仪器设备复杂、操作过程繁琐、检测人员要求高、检测成本高等缺点，提供了一种灵敏度高、特异性强、重现性好、操作简便且价廉易得的检测猪瘟病毒抗原CSFV的夹心型电化学免疫传感器的制备方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下措施来实现的。本发明的技术方案，包括以下步骤。

1. 一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器的制备方法

（1）将直径4 mm 的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 mm 的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于5 mmol·L^-1铁氰化钾溶液中，在-0.2 ~ 0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于80 mV；

（2）将pH 7.0，0.1 mol/L的磷酸盐缓冲溶液分散的MWCNTs-CD-Fc-Ab₁修饰于玻碳电极表面，室温干燥，所述MWCNTs-CD-Fc-Ab₁的浓度为1.0 ~ 3.0 mg·mL^-1；

（3）滴涂3 μL、100 μg·mL^-1的牛血清白蛋白溶液至电极表面，4℃下湿润条件下晾干；

（4）滴涂6 μL、0.001 ~ 5.0 ng·mL^-1的猪瘟病毒抗原CSFV标准溶液至电极表面，4℃下湿润条件下晾干；

（5）滴涂6 μL的Ab₂-CD-Ag-GOD溶液至电极表面，4℃下湿润条件下晾干，制得一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器。

2. 如上所述Ab₂-HS-β-CD-Ag-GOD共轭物溶液的制备方法

（1）HS-β-CD-Ag纳米材料的制备

将1 mL，0.005-0.015 mol/L的AgNO₃和1 mL，0.02-0.04 mol/L的柠檬酸三钠加入到97 mL的高纯水中，搅拌均匀，震荡滴加1 mL，1.5-2.0 mg/mL的NaBH₄，充分搅拌20 min，加入0.0238 g的巯基化β环糊精HS-β-CD，磁力搅拌24 h，转速为11000 rpm的条件下离心10 min，恒温60 ℃真空干燥；

（2）金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD的制备

称取25-41 mg金刚烷甲酸ADA于40 mL超纯水中，加入200 μL，0.5-1.5 mol/mL的NaOH溶液，溶液澄清后稀释至100 mL，在1-3 mL的金刚烷甲酸ADA溶液中加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS和2 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，室温搅拌0.5 h，加入200 μL，0.5-1.5 mg/mL的葡萄糖氧化酶，恒温4 ℃过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，于-20 ℃的条件下保存，制得100-300 μg/mL的金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD溶液；

（3）金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab₂的制备