[发明专利]一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器的制备方法及应用

权利要求书

1. 一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）将直径4 mm 的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 mm 的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于5 mmol·L^-1铁氰化钾溶液中，在-0.2 ~ 0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于80 mV；

（2）将pH 7.0，0.1 mol/L的磷酸盐缓冲溶液分散的MWCNTs-CD-Fc-Ab₁修饰于玻碳电极表面，室温干燥，所述MWCNTs-CD-Fc-Ab₁的浓度为1.0 ~ 3.0 mg·mL^-1；

（3）滴涂3 μL、100 μg·mL^-1的牛血清白蛋白溶液至电极表面，4℃下湿润条件下晾干；

（4）滴涂6 μL、0.001 ~ 5.0 ng·mL^-1的猪瘟病毒抗原CSFV标准溶液至电极表面，4℃下湿润条件下晾干；

（5）滴涂6 μL的Ab₂-CD-Ag-GOD溶液至电极表面，4℃下湿润条件下晾干，制得一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器。

2.如权利要求1所述的一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器的制备方法，所述Ab₂-HS-β-CD-Ag-GOD共轭物溶液的制备方法，步骤如下：

（1）HS-β-CD-Ag纳米材料的制备

将1 mL，0.005-0.015 mol/L的AgNO₃和1 mL，0.02-0.04 mol/L的柠檬酸三钠加入到97 mL的高纯水中，搅拌均匀，震荡滴加1 mL，1.5-2.0 mg/mL的NaBH₄，充分搅拌20 min，加入0.0238 g的巯基化β环糊精HS-β-CD，磁力搅拌24 h，转速为11000 rpm的条件下离心10 min，恒温60 ℃真空干燥；

（2）金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD的制备

称取25-41 mg金刚烷甲酸ADA于40 mL超纯水中，加入200 μL，0.5-1.5 mol/mL的NaOH溶液，溶液澄清后稀释至100 mL，在1-3 mL的金刚烷甲酸ADA溶液中加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS和2 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，室温搅拌0.5 h，加入200 μL，0.5-1.5 mg/mL的葡萄糖氧化酶，恒温4 ℃过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，于-20 ℃的条件下保存，制得100-300 μg/mL的金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD溶液；

（3）金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab₂的制备

称取25-41 mg金刚烷甲酸ADA于40 mL超纯水中，加入200 μL，0.5-1.5 mol/mL的NaOH溶液，溶液澄清后稀释至100 mL，在1-3 mL的金刚烷甲酸ADA溶液中加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS和2 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，室温搅拌0.5 h，加入200 μL，0.5-1.5 mg/mL检测抗体 Ab₂，恒温4 ℃过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，加入1 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，于-20 ℃的条件下保存，制得100-300 μg/mL的金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab₂溶液；

（4）Ab₂-HS-β-CD-Ag-GOD共轭物溶液的制备

将金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab₂和金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD稀释至40-60 μg/mL，取200 μL，40-60 μg/mL ADA-Ab₂和200 μL，40-60 μg/mL ADA-GOD，加入200 μL，3-5 mg/mL HS-β-CD-Ag，恒温4 ℃孵化过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，弃去上清液，加入200 μL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，于-20 ℃的条件下保存，制得Ab₂-HS-β-CD-Ag-GOD共轭物溶液；

（5） 多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁MWCNTs-CD-Fc复合材料的制备

称取0.4-0.6 g多壁碳纳米管MWCNTs，加入到已配好的H₂SO₄和HNO₃为3:1的混合溶液中，恒温40 ℃超声3 h，冷却至室温，用超纯水稀释到500 mL，使用0.22 μm的滤膜进行真空抽滤，超纯水洗涤到pH为中性，恒温60 ℃真空干燥，制得羧基化多壁碳纳米管MWCNTs-COOH；

称取20-30 mg MWCNTs-COOH，分散到50 mL超纯水中，然后加入150-250 mg的β-环糊精CD，震荡12 h，离心，水洗4次，恒温60 ℃真空干燥，60-100 mg二茂铁甲酸Fc加入到50 mL的二氯甲烷中，加入20-30 mg MWCNTs-CD，搅拌12 h，离心干燥，得多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁MWCNTs-CD-Fc复合材料；

（6）多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁-捕获抗体MWCNTs-CD-Fc-Ab₁的制备

称取3-5 mg的MWCNTs-CD-Fc分散到2 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液中，加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS，恒温4 ℃搅拌0.5 h, 加入200 μL, 0.5-1.5 mg/mL 捕获抗体Ab₁, 恒温4 ℃震荡12h，制得多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁-捕获抗体MWCNTs-CD-Fc-Ab₁。

3.如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器，用于猪瘟病毒抗原CSFV检测，其特征在于，包括如下步骤：

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器为工作电极，在10 mL、40~60 mmol/L的pH6.0 ~ 8.0磷酸盐缓冲溶液中测定其电流变化；

（2）根据所得电流差值与猪瘟病毒抗原CSFV浓度呈线性关系，绘制工作曲线；

（3）依据工作曲线的绘制方法进行样品中猪瘟病毒抗原CSFV的检测，检测结果从工作曲线中查得。