[发明专利]TALEs双识别检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种TALEs双识别检测方法及其应用。

背景技术

TALE (Transcription Activator Like Effectors)是一类DNA结合蛋白。它的DNA结合结构域是由可变数量的重复单元组成，天然 TALEs  主要由位于N端的转运信号（translocation signal）、位于C端的核定位信号（nuclear localization signals, NLS）和转录激活结构域（transcriptional activation domain, AD）以及位于中间的 DNA 结合结构域三部分组成。DNA结合结构域由包含 33~35（通常为 34）个氨基酸残基的重复单元串联而成，介导 DNA 特异识别与结合。每个重复单元序列高度保守，主要区别在于第 12和第 13 位的重复可变双残基（repeat variant di-residue, RVD）。研究发现每个重复单元的 RVD 决定了其所识别的核苷酸，且其识别遵循一个简单法则：NI=A, HD=C, NG=T, NN=G or A。TALEs 理论上可以识别任何 DNA 序列。

目前还没有用TALEs蛋白用于基因的诊断，本发明TALEs双识别检测技术，用它做突变检测。该方法不仅可以用于科研的检测，也可以用于临床诊断。

发明内容

解决的技术问题：

本发明的目的在于克服现有技术的不足而开发的一种TALEs双识别检测方法，该方法可检测出不同的基因，点突变等，可用于分子诊断、基因表达的研究，本发明检测灵敏度比较高，假阳性率比较低。

技术方案：

本发明利用TALEs识别DNA的特性，表达特异识别DNA序列的TALEs蛋白，然后把识别不同DNA序列的蛋白做包被在微孔板上。再然后加入DNA样品与包被在微孔板上的TALEs蛋白结合，接着再加入偶联有碱性磷酸酶的TALEs蛋白，该蛋白特异识别DNA序列，最后加入碱性磷酸酶的底物，化学发光检测。从而检测出不同的基因，点突变等。

TALEs双识别检测方法，步骤如下：

步骤一：TALEs原核蛋白表达质粒的构建：用NdeI和BamHI切pET-16b载体，然后把TALEs序列克隆到pET-16b载体的NdeI和BamH位点，得pET-16b-TALEs原核表达载体；

步骤二：原核表达TALEs蛋白：将步骤一制备的pET-16b-TALEs原核表达载体转化到大肠杆菌BL21中，IPTG诱导，收集细菌并裂解细胞，离心取上清液，进行Ni柱亲和层析，待目的蛋白与Ni柱结合之后，用漂洗液洗涤，后用洗脱缓冲液冲洗，将洗脱组分中的高盐缓冲液置换成PBS溶液，最后进行SDS-PAGE的检测，所得即为纯化的TALEs蛋白。

步骤三： TALEs蛋白定向高密度包被在微孔板上。加入提取的DNA样品，DNA被包被在微孔板上的TALEs蛋白包捕获。

步骤四：用偶联有碱性磷酸酶的TALEs蛋白识别被捕获的DNA，加入碱性磷酸酶的底物，产生化学发光信号，并判读信号。

所述的TALEs双识别检测方法在基因诊断中的应用。

有益效果

本发明打破基因芯片的核酸结合核酸，蛋白芯片中蛋白识别蛋白的特性，以蛋白特异性识别DNA，稳定，而且灵敏度比较高，可以用于快速诊断。与现有技术相比，本发明的优点是可以高通量检测不同的基因和多个突变位点，该方法不仅可以用于科研的检测，也可以用做临床诊断。

附图说明

图1为用化学发光法检测的信号结果图，结果如图1所示，TALEs检测EGFR基因T790M位点的检测结果。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1  

1、材料： pET-16b购于Novagen、大肠杆菌BL21购于Takara，标记有碱性磷酸酶的TALEs蛋白由北京博奥森生物技术有限公司标记。

2、方法