[发明专利]一种烟草疫霉侵染过程的实时观察方法

权利要求书

1.一种烟草疫霉侵染过程的实时观察方法，其特征在于包括烟草子叶苗的准备、烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备、灌根接种、染色观察步骤，具体包括：

A、烟草子叶苗的准备：将烟草种子表面消毒后播种于发芽床上，于相对湿度80~85%、光照强度1000~2000Lx、温度25~28℃下培养7~10天后发芽形成子叶苗备用；

B、烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备：将烟草疫霉接种至OA培养基平板，于25~28℃下黑暗培养7~10天至菌丝长满整个平板，取菌丝切成小块得到菌丝块，液体培养诱导产生游动孢子囊、低温促进游动孢子囊释放游动孢子疫霉，用无菌水调节游动孢子浓度为10^4~6个/ml得到烟草疫霉游动孢子悬浮液；

C、灌根接种；取B步骤获得的烟草疫霉游动孢子悬浮液缓慢滴加至发芽床，让其渗透到每株子叶苗的根部；

D、染色观察：接种后的子叶苗在相对湿度80~85%、光照强度1000~2000Lx、温度25~28℃下继续培养，每隔4小时取子叶苗，去除子叶及子叶相连胚根的2/3，得胚根样品，浸没到台盼蓝或苯胺蓝工作液中，沸水水浴1min，室温至少12小时过夜，取出染色子叶苗胚根放入水合三氯乙醛溶液中脱色至少30分钟，纯水冲洗样品1~3次，显微观察样品细胞死亡、孢子萌发和菌丝生长情况。

2.根据权利要求1所述的烟草疫霉接种烟草的方法，其特征在于A步骤中所述的表面消毒是50~55℃温汤浸种8~10分钟，或1%硫酸铜或0.1%硝酸银溶液浸种10~15分钟。

3.根据权利要求1所述的烟草疫霉接种烟草的方法，其特征在于所述的发芽床是由海绵和滤纸做成。

4.根据权利要求1所述的烟草疫霉接种烟草的方法，其特征在于B步骤中所述的OA培养基配方为：燕麦片30克、自来水1000毫升。

5.根据权利要求1所述的烟草疫霉接种烟草的方法，其特征在于B步骤中所述的10%V8汁液体培养基配方为：用自来水稀释V8汁至10%、再加0.1%的碳酸钙。

6.根据权利要求1所述的烟草疫霉接种烟草的方法，其特征在于B步骤中所述的菌丝块的大小为2mm×2mm。

7.根据权利要求1所述的烟草疫霉接种烟草的方法，其特征在于B步骤中所述的液体培养诱导产生游动孢子囊是将菌丝块加入到10%V8汁液体培养基的培养皿中，每皿加菌丝块20~40片，继续于25~28℃下黑暗培养3~4天，倾去培养液，用灭菌水冲洗3~5次，每天换加灭菌水1~3次，连续2~3天诱导游动孢子囊的产生，直至每平方厘米菌丝块游动孢子囊在10000个以上时停止诱导。

8.根据权利要求1所述的烟草疫霉接种烟草的方法，其特征在于B步骤中所述的低温促进游动孢子囊释放游动孢子是将产生游动孢子的菌丝块5~8℃低温处理20~30min，取出置于室温15~30min诱导游动孢子囊释放游动孢子。

9.根据权利要求1所述的烟草疫霉接种烟草的方法，其特征在于C步骤中所述的烟草疫霉游动孢子悬浮液滴加量为10~15毫升。