[发明专利]一种烟草疫霉侵染过程的实时观察方法

说明书

技术领域

本发明属于病菌与植物互作研究技术领域，具体涉及一种烟草疫霉侵染过程的实时观察方法。

背景技术

烟草黑胫病是由烟草疫霉（Phytophthora nicotianae) 引起的一种土传病害，是影响烟草产量和品质的主要病害之一。研究表明，烟草疫霉集中在距土表5厘米的范围内活动，侵染部位主要是茎基部和根。带菌的土壤、粪肥及灌溉水是烟草黑胫病的主要初侵染源，其次为带病烟苗，其产生的孢子囊和游动孢子借雨水或灌溉水传播，可通过气孔、伤口或穿透幼嫩表皮细胞的角质层侵入引起再浸染。但至目前为止，烟草疫霉侵染烟草的过程了解得并不多。因此，开发一种能解决上述问题的方法是非常必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种烟草疫霉侵染过程的实时观察方法。

本发明的目的是这样实现的，包括烟草子叶苗的准备、烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备、灌根接种、染色观察步骤，具体包括：

A、烟草子叶苗的准备：将烟草种子表面消毒后播种于发芽床上，于相对湿度80~85%、光照强度1000~2000Lx、温度25~28℃下培养7~10天后发芽形成子叶苗备用；

B、烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备：将烟草疫霉接种至OA培养基平板，于25~28℃下黑暗培养7~10天至菌丝长满整个平板，取菌丝切成小块得到菌丝块，将菌丝块加入到10%V8汁液体培养基的培养皿中，每皿加菌丝块20~40片，继续于25~28℃下黑暗培养3~4天，倾去培养液，用灭菌水冲洗3~5次，每天换加灭菌水1~3次，连续2~3天诱导游动孢子囊的产生，当每平方厘米菌丝块游动孢子囊在10000个以上时，5~8℃低温处理20~30min，取出置于室温15~30min诱导游动孢子囊释放游动孢子，疫霉用无菌水调节游动孢子浓度为10^4~6个/ml得到烟草疫霉游动孢子悬浮液；

C、灌根接种；取B步骤获得的烟草疫霉游动孢子悬浮液缓慢滴加至发芽床，让其渗透到每株子叶苗的根部；

D、染色观察：接种后的子叶苗在相对湿度80~85%、光照强度1000~2000Lx、温度25~28℃下继续培养，每隔4小时取子叶苗，去除子叶及子叶相连胚根的2/3，得胚根样品，浸没到台盼蓝或苯胺蓝（trypan blue）工作液（储存液：10g 苯酚、10ml 甘油、10ml 乳酸、10ml ddH₂O、0.02g trypan blue；工作液：1v储存液:2v96%乙醇。）中，沸水水浴1min，室温至少12小时过夜，取出染色子叶苗胚根放入水合三氯乙醛溶液（脱色液：1kg水合三氯乙醛 chloral hydrate溶解于400mL水）中脱色至少30分钟，纯水冲洗样品1~3次，显微观察样品细胞死亡、孢子萌发和菌丝生长情况。

本发明借助相关的病菌与寄主互作的观察方法，结合烟草疫霉侵染烟草的特点，在疫霉纯培养显微观察的基础上加以改进，提出了一种烟草疫霉侵染过程的实时观察方法，可望为病害的防治提供新途径。

本发明具有以下优点及效果：

一是本发明操作过程在人工气候箱/室进行，2~3天内可完成侵染观察，省空间、省时间、省劳力，具有操作简便、快捷的优点。

二是本发明技术原理明确，即利用烟草游动孢子的根部趋化性，使游动孢子富集于子叶苗的胚根，形成休止孢后直接穿透幼嫩表皮细胞的角质层侵入胚根，且在合适的温湿度环境下发病迅速、典型、稳定的特点，拨取子叶苗、剪胚根，取样简单，极大地提高了工作效率。

附图说明

图1 为本发明方法流程示意图；

图2 为烟草疫霉侵染子叶苗胚根24小时后的激光共聚焦观察结果；

图3 为烟草疫霉侵染子叶苗胚根的过程图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的烟草疫霉侵染过程的实时观察方法，包括烟草子叶苗的准备、烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备、灌根接种、染色观察步骤，具体包括：

A、烟草子叶苗的准备：将烟草种子表面消毒后播种于发芽床上，于相对湿度80~85%、光照强度1000~2000Lx、温度25~28℃下培养7~10天后发芽形成子叶苗备用；