[发明专利]一种p53蛋白的电子介体型酶促电化学免疫检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种p53蛋白的检测方法。

背景技术

p53蛋白，系人类肿瘤相关性最高基因p53的表达产物，是一种最具代表性的重要肿瘤相关蛋白。人体正常细胞中存在的p53蛋白量很低，这些低含量的p53蛋白极易被水解，且半衰期很短，仅有10-20分钟的，一般难以觉察。p53蛋白的传统检测方法是免疫分析法，如放射免疫分析(RIA)、免疫组织化学法(IHC)及酶联免疫分析(ELISA)等。RIA方法具有放射污染性，不易在临床推广。IHC法仅见应用于组织标本和细胞标本中p53蛋白表达的研究，其操作程序复杂，所需时间较长。ELISA是目前最常用的方法，其既可定性诊断又可定量诊断，同时可测定的标本数量很大；但其标记过程复杂、时间长，所需免疫试剂多，易引入随机误差且检测信号放大程度有限。后又发展了流式荧光技术(xMAP)和组织微阵列技术(TMA)检测p53蛋白，但其仪器投入费用和耗材较贵。p53蛋白的新的、便捷有效的检测手段或方法是目前的前沿热点课题。

电子介体型的酶促电化学免疫传感器属电化学免疫传感器，其既具有电化学分析法的简单快速、灵敏度高、成本低、不受样品颜色和浊度的影响及所需仪器设备简单，又具有免疫分析的高选择性和专一性，协同酶促电子介体有效放大检测信号，其受到众多研究者的广泛关注。但应用电子介体型的酶促电化学免疫传感器检测肿瘤蛋白p53国内外却罕见相关报道。仅见Yuehe Lin等分别应用石墨烯-壳聚糖、纳米金修饰的丝网印刷碳电极结合单体硫堇-辣根过氧化物酶-H₂O₂模型体系构建电子介体型的酶促电化学免疫传感器先后检测了磷酸化的p53(S15)和(S392)。因临床实际样品组成复杂，其中p53蛋白浓度极低且不能进行直接扩增，现有方法很难实现实际样品中p53蛋白的特异性检测；如何进一步有效提高检测方法的灵敏度是亟待解决的关键问题。

纳米纤维是指直径为纳米尺度而长度较大的线状材料。除具有纳米材料的基本特性外，还具有极高的长径比、孔隙率高、生物相容性较好、结构丰富、精细程度与均一性高、持久耐用及易于修饰再加工等优点，是一种潜在的具有广阔应用前景的生物分子固定化载体材料。将纳米纤维与酶促电子介体有效结合，用于构建电子介体型的酶促电化学免疫传感器国内外未见相关报道，应用其特异性、高灵敏检测肿瘤蛋白p53，是值得人们研究的重要课题。

发明内容

发明目的：针对p53蛋白的传统检测方法的不足，本发明提供了一种通过构建电子介体型酶促电化学免疫分析系统进行定量检测p53蛋白的方法。

技术方案：本发明所述的p53蛋白的电子介体型酶促电化学免疫检测方法，按以下步骤进行：

(1)制备免疫分子固定化活性界面：

将尼龙6与羧基化多壁碳纳米管MWCNTs溶解于1:1～19:1,v/v的间甲酚/甲酸的混合溶剂中形成复合纳米纤维PA6-MWCNTs混合物，再将该混合物在室温下连续搅拌，制得前驱体静电纺丝溶液；

将前驱体静电纺丝溶液置于注射器中，高压静电发生器的正极连接注射器针头，负极连接在裸电极上，采用微量注射泵供液，由高压静电发生器产生的高压静电直接施加在注射器针头上，复合纳米纤维PA6-MWCNTs收集于裸电极上，形成复合纳米纤维PA6-MWCNTs修饰电极；

将复合纳米纤维PA6-MWCNTs修饰电极浸于含有硫堇单体的聚合液中，对聚合液加以搅拌，搅拌速率为550～650r/min，温度为28～32℃。先对此修饰电极施加电压进行阳极化处理，然后进行循环伏安扫描，最后修饰电极用磷酸缓冲溶液PBS洗去吸附在修饰电极上的硫堇单体，形成聚硫堇功能化的复合纳米纤维PA6-MWCNTs-PTH修饰电极，即获得PA6-MWCNTs-PTH免疫分子固定化活性界面。该PA6-MWCNTs-PTH免疫分子固定化活性界面，在磷酸缓冲液中保存2天后，电流响应几乎不变。

(2)构建电子介体型酶促电化学免疫分析系统：