[发明专利]一种p53蛋白的电子介体型酶促电化学免疫检测方法

权利要求书

1.一种p53蛋白的电子介体型酶促电化学免疫检测方法，其特征在于所述的检测方法按以下步骤进行：

(1)制备免疫分子固定化活性界面：以尼龙6与羧基化多壁碳纳米管为原料经静电纺丝、电聚合硫堇得到聚硫堇功能化的复合纳米纤维PA6-MWCNTs-PTH修饰电极；

(2)构建电子介体型酶促电化学免疫分析系统：

将步骤(1)所得的PA6-MWCNTs-PTH修饰电极与捕获抗体Ab₁温育，电极经PBS溶液清洗，除去电极表面非特异性吸附的Ab₁，然后浸入含巯基乙醇的牛血清蛋白中放置，以封被电极表面未被捕获抗体覆盖的活性位点，得到捕获抗体修饰电极；

将所述的捕获抗体修饰电极与检测肿瘤蛋白p53温育，电极经PBS溶液清洗，得到检测肿瘤蛋白p53电极；

将所述的检测肿瘤蛋白p53电极与HRP标记的检测抗体HRP@Ab₂温育，电极经PBS溶液清洗，获得三明治Ab₁-AG_p53-HRP@Ab₂复合物修饰电极；

将所述三明治Ab₁-AG_p53-HRP@Ab₂复合物修饰电极作为工作电极，Ag/AgCl或饱和KCl电极作为参比电极，Pt丝电极作为对电极，构成三电极体系，经所述三电极体系构建电子介体型酶促电化学免疫分析系统；

(3)p53蛋白定量检测：

采用步骤(2)得到的分析系统，结合标准曲线对p53蛋白进行定量检测；所述标准曲线是以系列p53蛋白标准溶液的浓度为横坐标，差分脉冲伏安法差值为纵坐标绘制标准曲线；其中DPV强度差值是p53蛋白的DPV强度减去空白液的DPV强度。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤(1)在电聚合硫堇过程中对聚合液加以搅拌和控温，搅拌速率为550～650r/min，温度为28～32℃。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤(2)中第一次温育体系含乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤(2)中含巯基乙醇的牛血清蛋白浓度为1wt％，其中含有0.1wt％巯基乙醇。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤(2)中电极浸入含巯基乙醇的牛血清蛋白中放置时间为30min，温度为室温。

6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤(2)中的三次温育温度均为37℃，温育时间均为50min。

7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤(2)中构建的电子介体型酶促电化学免疫分析系统主要参数设置为：电位扫描范围-0.4～+0.15V，振幅0.05V，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.2s；检测液为0.1M PBS含4.0mmol/L H₂O₂，pH值为6.0。

8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述免疫分子固定化活性界面制备步骤为：将尼龙6与羧基化多壁碳纳米管溶解于1:1～19:1,v/v的间甲酚/甲酸的混合溶剂中形成PA6-MWCNTs混合物，再将该混合物在室温下连续搅拌，制得前驱体静电纺丝溶液；

将前驱体静电纺丝溶液置于注射器中，高压静电发生器的正极连接注射器针头，负极连接在裸电极上，采用微量注射泵供液，由高压静电发生器产生的高压静电直接施加在注射器针头上，复合纳米纤维PA6-MWCNTs收集于裸电极上，形成复合纳米纤维PA6-MWCNTs修饰电极；

将复合纳米纤维PA6-MWCNTs修饰电极浸于含有硫堇单体的聚合液中，先对此修饰电极施加电压进行阳极化处理，然后进行循环伏安扫描，最后修饰电极用磷酸缓冲溶液PBS洗去吸附在修饰电极上的硫堇单体，形成聚硫堇功能化的复合纳米纤维PA6-MWCNTs-PTH修饰电极，即获得PA6-MWCNTs-PTH免疫分子固定化活性界面。

9.如权利要求1或8所述的检测方法，其特征在于所述的PBS溶液浓度为10mmol/L pH值为7.2，其中含有10mmol/L K⁺、2mmol/L Mg²⁺、1mmol/L巯基乙醇和1mmol/L ATP。

10.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于聚硫堇功能化的复合纳米纤维PA6-MWCNTs-PTH既作为免疫分子固定化活性界面用于捕获Ab₁有效提高免疫分子的固载量，同时又作为电子介体经PTH-HRP-H₂O₂放大电学检测信号。