[发明专利]一种用MALDI-TOT-TOF质谱对蛋白质N端序列进行从头测序的方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质测序技术领域，具体涉及一种用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间(MALDI-TOT-TOF)质谱对蛋白质N端序列进行从头测序的方法和试剂盒。

背景技术

所有蛋白质的合成都起始于N端，N末端序列具有很高的特异性，可用于鉴定蛋白且对其生物学功能有着巨大的影响。因此，通过对蛋白质N端序列的研究有利于分析蛋白质的高级结构，揭示蛋白质的生物学功能。

目前对蛋白N端测序主要分为两大类，其一为非质谱技术，例如经典的Edman降解法、利用反转录RT-PCR得到对应蛋白的cDNA，再来反推得到蛋白序列；其二为质谱技术。经典的Edman降解法已经广泛应用于蛋白质的N端测序，对于整体纯化的蛋白的N端序列分析仍是很有价值的研究工具。但是Edman降解法受到以下诸多限制：①用于序列分析的蛋白质或多肽必须是高纯度的；②N端封闭的蛋白质难以进行Edman反应；③不适于高通量分析，灵敏度不够。利用反转录RT-PCR得到对应蛋白的cDNA，再来反推得到蛋白序列，其特点是更加简便、快速，但它对翻译加工所导致的氨基酸残基的修饰及突变等情况无能为力。

质谱技术已成为当前进行蛋白质鉴定和蛋白质N末端肽测定的主要方法，通过将蛋白质酶切后，对所产生的肽段进行二级质谱分析，再进行数据库搜索而进行鉴定，这些数据库是唯一适于基因组已经测序的生物体。尽管被测序的生物数量越来越多，仍然有大量的遗传密码未知的物种。另一方面由于蛋白质序列的不知原因的突变，蛋白质序列的多形态，数据库中的序列错误以及蛋白质的翻译后修饰等原因存在，使得基于数据库搜索的蛋白质鉴定和蛋白质N末端肽测定存在困难。从头测序方法(de Novo)不依赖现有的数据库，根据肽段有规律碎裂的特点，直接从图谱中推导出肽段的序列，能够分析新物种、基因组未测序物种以及蛋白质的翻译后修饰的串联质谱数据，具有数据库搜索方法不可替代的优势。

许多对末端肽的研究方法采用的是质谱技术与多种化学方法及生物酶法的结合。通过N端的各种化学标记，运用MS/MS或多级质谱(MSⁿ)的碰撞诱导裂解(CID)、源后裂解(PSD)等碎裂技术测序；或标记的N端肽段先经过选择性的分离，再进行从头测序。在所报道的用于标记N端肽段的试剂中，(N-琥珀酰亚胺基氧代羰基甲基)三(2,4,6-三甲氧苯基)溴化膦(TMPP-Ac-OSu)引起大家极大的兴趣，它被用于多肽的从头测序、翻译后修饰和N端测序，其特点是标记TMPP-Ac后的肽段，在用MALDI-TOF/TOF质谱仪进行CID或PSD碎裂时，产生特征的573.2峰，且主要产生连续的a离子系列，图谱简单，便于从头测序；但是过量的反应试剂及其副产物严重干扰随后的反相液相色谱分析(RP-LC)和质谱分析，影响其广泛应用于蛋白质组学。目前报道的方法不仅将TMPP-Ac标记在蛋白质N端，而且还标记在中间肽和其中的赖氨酸上，因此难以识别出蛋白质N端肽。另一方面，赖氨酸的分子量为(128.09496)与谷氨酰胺的分子量(128.05858)相差很近，难于分辨。

发明内容

本发明的目的是提供一种简单快速高灵敏度的、具有良好特异性和普适性，既可对蛋白质N端进行测序，又可对其进行从头测序的高通量方法，具体为一种用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间(MALDI-TOT-TOF)质谱对蛋白质N端序列进行从头测序的新方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种用MALDI-TOT-TOF质谱对蛋白质N端序列进行从头测序的方法，该方法涉及蛋白质的分离、还原烷基化、蛋白质的化学修饰、酶解、分离富集修饰的蛋白质N端肽段以及N端肽段的质谱识别和从头测序，具体步骤包括：

(1)用一维凝胶电泳(SDS-PAGE GEL)分离蛋白质或将蛋白质凝结在胶上；

(2)在胶内用还原剂打开蛋白质分子中的二硫键，破坏其高级结构；用烷基化试剂封闭巯基，防止其重新形成二硫键；

(3)在胶内对蛋白质的赖氨酸进行胍基化；

(4)在胶内对蛋白质N端氨基进行酰基化修饰，然后进行终止和洗涤，去除过量的修饰试剂和相应的副产物；

(5)用化学消化或酶消化法对蛋白质进行消化，产生适于质谱分析的肽段；

(6)用质谱分析技术分析蛋白质N端肽段，使其裂解产生碎片离子的质谱图；

(7)用反相液相色谱技术分离富集蛋白质N端肽段，用质谱分析技术高通量地测定蛋白质N端肽段。

其中：

所述胍基化为用O-甲基异脲或S-甲基异脲进行胍基化修饰。