[发明专利]以PAMAM为间隔臂的仿生免疫吸附剂及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医疗器械，提供了一种血液净化用仿生免疫吸附剂的制备方法，特别是可用于血液灌流的免疫吸附剂及其制备方法。

背景技术

免疫吸附疗法是近二十年来发展起来的一种新技术，用于治疗一些传统方法难以奏效的疾病。目前临床上应用免疫吸附能通过特异性的清除自身抗体治疗多种自身免疫性疾病。如以蛋白A，G等为配基的蛋白类免疫吸附剂对免疫球蛋白(IgG)有很好的生物特异性亲和力，含有这类生物特异性配基的免疫吸附剂已证明能去除自身抗体并治疗各种自身免疫性疾病，因而在生物纯化及临床上得到了广泛应用。然而，蛋白类配基存在一些无法忽视的缺陷：蛋白质难以经受苛刻的灭菌过程并且较易从载体上脱落，这些脱落的配基会引起安全问题；蛋白类免疫吸附剂高昂的价格给患者造成了沉重的经济负担；蛋白质配基难以进行化学官能团的修饰，因而不能以最合适的角度偶联在载体上。为了解决这些问题，一批能选择性地结合IgG的仿蛋白质类的小分子配基得到了广泛的研究和发展。例如，氨基酸、多肽、染料、金属离子等这类具有高度物理化学稳定性和低廉价格的小分子，能作为蛋白质配基的替代品用于吸附IgG。在这些仿生配基中，氨基酸由于其无毒，价廉和对IgG的高选择性已代替蛋白质用于亲和色谱方面。有报道证明氨基酸能高效地从人血浆或血清中分离出IgG。

在常用的免疫吸附剂的制备方法中，配基通过氨基、羟基、羧基、醛基等反应基团偶联于载体上。但是，当配基上存在过多的化学官能团或者存在其它能参与偶联反应的基团时，载体与配基用于偶联反应的官能团间的选择性会减低，从而使配基的亲和力受到影响。因此，增加载体与配基在偶联反应时的选择性就显得尤为重要。如果一对官能团彼此间有很高的反应选择性并且它们对其它基团是惰性的，那么这样的官能团对就能大大提高免疫吸附剂的制备效率。而叠氮基和炔基正是这样的官能团对，二者的Huisgen 1,3-偶极环加成反应是点击化学反应里应用最广泛的。Cu(I)-催化的叠氮基和炔基的环加成反应具有高选择性，且对很多其它的化学官能团是惰性的，并在很广的反应条件下(溶剂、温度、pH等)都能保持稳定。这些特征使得点击化学在生物藕联方面显示出独特的优势，例如亲和色谱试剂的制备。专利CN201210152387.3中，通过分别制备了叠氮化的载体和炔化的配基，并且将二者通过点击反应偶联后制备了免疫吸附剂。其中，要制备叠氮化的载体，需将其先环氧化后再通过活化基团进行叠氮化，但该制备方法存在局限性，如叠氮化琼脂糖的叠氮基含量影响后续通过点击反应固载上的配基量，而叠氮基含量则直接受限于环氧基含量。通过专利(申请号：01103114.X)报道的环氧氯丙烷活化法所得到的活化载体，其环氧值约为60μmol/mL。而在尝试了多种环氧活化的优化方法后，发现活化载体的环氧值难以有明显的提高，配基固载量也难以进一步提高。因此，本发明采用了一种新的活化载体和吸附剂的制备方法，以提高载体的活性位点数，增加吸附剂的配基固载量，从而有效地提高吸附剂的吸附性能。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种安全、成本低廉，性能稳定可靠的以PAMAM为间隔臂的仿生免疫吸附剂。本发明的第二目的在于提供以PAMAM为间隔臂的仿生免疫吸附剂的制备方法。本发明的第三目的在于提供该类以PAMAM为间隔臂的仿生免疫吸附剂在IgG分离中的应用。

本发明以琼脂糖、纤维素和聚乙烯醇等含羟基的亲水凝胶球为载体，氨基酸为仿生配基，采用点击化学设计和制备一种以聚酰胺-胺树枝状高分子物质(PAMAM)为间隔臂的免疫吸附剂，对IgG具有高选择性，且成本低廉，性能稳定可靠，效果与蛋白A吸附材料相当。以树枝状聚合物为间隔臂可克服线形间隔臂的缺点并增大载体对配基的固载量。聚酰胺-胺树状高分子既具有树状大分子的共性，又有自身特色：PAMAM是以乙二胺为核心，通过Michael加成和酰胺化缩合反应来进行的，整个反应的产率非常高；在凝胶载体上连接PAMAM型树枝状大分子，充分利用其大量活性位点的优势进行配基的固定化，偶联这种树枝状间隔臂后的载体比偶联线形间隔臂的载体的外表面具有更多的活性位点，更易于配基的键合，大大提高配基固载效率，增加免疫吸附剂的吸附能力。琼脂糖、纤维素和聚乙烯醇等载体具有良好的化学稳定性和机械强度，对蛋白质呈化学隋性，其亲水性和血液相容性也比较好，容易活化并在比较温和、简单的条件下可进行配基的固载反应。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种以PAMAM为间隔臂的仿生免疫吸附剂，具有如下Gel-PAMAM-AA的化学结构：