[发明专利]低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株及其构建方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株及其构建方法。

背景技术：

纯生啤酒是指采用无菌酿造、无菌过滤、无菌包装生产的一种健康时尚、口感新鲜、自然、卫生、安全营养的鲜啤酒。由于在生产过程中没有经过巴氏杀菌或瞬间杀菌，避免了加热造成的风味物质和营养成分的破坏，保持了啤酒的新鲜口味和成分，因而与普通啤酒相比，纯生啤酒更纯正、更爽口、更新鲜、营养更丰富。

然而，纯生啤酒在泡沫质量方面存在着明显的质量缺陷，即随着货架时间的延长，泡沫稳定性逐渐下降。因此，提高纯生啤酒的泡沫稳定性一直是纯生啤酒生产厂家亟待解决的技术难题。国内外研究资料表明，蛋白酶A是导致纯生啤酒泡持性下降的主要原因。蛋白酶A(EC 3.4.23.6)是在啤酒发酵过程中由酵母分泌的一种酸性蛋白酶。纯生啤酒因未经巴氏杀菌而残存蛋白酶A，随着货架时间的延长，蛋白酶A会分解啤酒内的泡沫活性蛋白而导致啤酒泡沫泡持性下降。

目前，国内外主要从添加蛋白酶A抑制剂、优化发酵工、菌种改造等方面入手来降低蛋白酶A，提高啤酒泡沫稳定性。添加蛋白酶A抑制剂虽可降低蛋白酶A的活性，但外源物质的加入可能会影响啤酒的风味、稳定性和安全性。从发酵工艺来看，为了维持啤酒的风味特征，啤酒发酵的原辅料处理、发酵温度、灌压等条件相对固定，通过调整这些条件来降低蛋白酶A分泌，提高啤酒泡沫稳定性的空间不大。通过敲除蛋白酶A基因的方法虽可降低蛋白酶A的分泌，但同时会影响酵母的生理生化特性。

常规条件下，蛋白酶A定位于酵母细胞液泡内，参与液泡内多种蛋白的成熟和激活过程。有研究表明，在氮源缺乏、CO₂浓度过高或酒精度过高等胁迫条件下，蛋白酶A可以分泌到胞外，并推测是可能是通过缺省途径(default pathway)来完成的。研究表明常规条件下，组成型分泌途径是细胞膜蛋白和分泌型蛋白的主要运输途径，但目前对于胁迫条件下组成型蛋白分泌途径的研究报道很少，尤其是对于蛋白酶A在胁迫条件下外分泌途径的研究更是空白。常规条件下，细胞内的组成型分泌途径是通过囊泡来介导完成的，包括四个步骤：囊泡的出芽、转运、栓系和融合。而胞吐复合体在囊泡的栓系和融合过程中发挥重要作用，由八个不同的亚基(Sec3p、Sec5p、Sec6p、Sec8p、Sec10p、Sec15p、Exo70p和Exo84p)组合而成，其中Sec5p是复合体的核心因子，维持着胞吐复合体的完整性和稳定性。有研究表明，将果蝇的SEC5基因敲除后会影响生殖细胞的生长及细胞中膜的极性运输，并使其对温度敏感；将酵母中的SEC5基因敲除会引起菌体对温度的异常敏感。

目前通过敲除酿酒酵母组成型分泌途径中的关键蛋白因子Sec5p来降低胁迫条件下蛋白酶A的分泌量的方法尚未见报道。本发明通过敲除酵母中组成型分泌途径中胞吐复合体的核心因子Sec5p的基因来选育适合啤酒发酵的低分泌蛋白酶A的酿酒酵母菌株，从而提高啤酒的泡沫稳定性。

发明内容：

本发明所解决上述技术问题所采用的技术方案是通过敲除酿酒酵母出发菌株中编码组成型分泌途径中的关键蛋白因子Sec5p的SEC5基因全序列，获得低蛋白酶A酿酒酵母菌株。

所述SEC5基因其Gene ID为：851744，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

优选的，所述酿酒酵母出发菌株为模式菌株W303-1A；

优选的，所述酿酒酵母出发菌株为工业菌株S6。

所述低蛋白酶A分泌的酿酒酵母菌株的构建方法，包括如下步骤：

(1)将含有SEC5基因的上、下游序列的DNA分子及标记基因KanMX插入质粒中，得到重组质粒；

(2)以重组质粒为模板扩增出含有SEC5基因的上、下游序列及标记基因KanMX的重组片段，将重组片段转化入酿酒酵母出发菌株中，得到重组后的基因工程菌株；

(3)KanMX抗性基因的去除；

(4)pGAPza质粒丢失

具体如下：

(1)重组质粒的构建

①以出发菌株总DNA为模板，PCR扩增出SEC5基因的上、下游序列；

②以含有Amp抗性的穿梭质粒pUC6为模板，PCR扩增出KanMX抗性基因；

③将步骤(1)-①和(1)-②获得的PCR产物依次连接到含有Amp抗性的pUC19质粒上，获得重组质粒；

(2)SEC5基因的敲除