[发明专利]低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株及其构建方法

权利要求书

1.一种低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株，其特征在于，所述菌株通过敲除出发菌株中编码组成型分泌途径中的关键蛋白因子Sec5p的SEC5基因全序列获得。

2.如权利要求1所述的一种低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株，其特征在于，所述SEC5基因其Gene ID为：851744。

3.如权利要求1所述的一种低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株，其特征在于，所述出发菌株为模式菌W303-1A。

4.如权利要求1所述的一种低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株，其特征在于，所述出发菌株为工业菌株S6。

5.一种构建权利要求1所述低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株的方法，包括如下步骤：

(1)将含有SEC5基因的上、下游序列的DNA分子及标记基因KanMX插入质粒中，得到重组质粒；

(2)以重组质粒为模板扩增出含有SEC5基因的上、下游序列的DNA分子及标记基因KanMX的重组片段，将重组片段转化入出发菌株中，得到重组后的基因工程菌；

(3)采用Cre-LoxP报告基因挽救系统剔除重组后的基因工程菌中的KanMX抗性基因，并丢失以此引入的pGAPza质粒；

(4)多倍体工业菌株则重复步骤(2)-(3)。

6.根据权利要求5所述的一种构建低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)重组质粒的构建

①以出发菌株总DNA为模板，PCR扩增出SEC5基因的上、下游序列；

②以含有Amp抗性的穿梭质粒pUC6为模板，PCR扩增出KanMX抗性基因；

③将步骤(1)-①和(1)-②获得的PCR产物连接到质粒载体上，获得重组质粒；

(2)SEC5基因的敲除

①以步骤(1)中的重组质粒为模板，扩增出含有SEC5基因的上、下游序列的DNA分子及标记基因KanMX的重组片段；

②用醋酸锂转化法将(2)-①中的重组片段转化入出发菌株中，得到重组菌株；

(3)KanMX抗性基因的去除

①利用醋酸锂转化法将pGAPza质粒转入步骤(2)-②中的重组菌株中，

②用Zeocin抗性平板筛选转化子，挑选在YEPD平板上生长而在G418平板上不生长的基因工程菌株；

(4)pGAPza质粒丢失

将步骤(3)-②中挑选的基因工程菌株于YEPD液体培养基中进行传代培养，选取第一代及第十代以后各培养物提取酵母质粒并以此为模板，用引物进行PCR扩增，验证pGAPza质粒是否丢失；

(5)工业菌株进行第二条等位基因敲除

利用(2)-②中所述方法向(4)中得到的菌株中导入(2)-①所得的重组片段，筛选得第二条等位基因缺失的重组工业菌株，并按照步骤(3)和(4)去除KanMX抗性基因。

7.根据权利要求5或6所述的一种构建低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株的方法，其特征在于：用于构建所述重组质粒的载体为含有Amp抗性的pUC19质粒。

8.权利要求1所述的一种低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株在啤酒发酵中的应用。

9.一种检测如权利要求1所述低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株的方法，其特征在于，以重组菌株的总DNA为模板，通过引物对：

上游引物：5’-GGAGTTGCTTCCAGTGGCTTAG-3’

下游引物：5’-CGTCAAGACTGTCAAGGAGGGT-3’

进行PCR扩增，可获得一条长度为1276bp的特异性条带，所述特异性条带核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；

通过引物对：

上游引物：5’-TCGCAGACCGATACCAGGATC-3’

下游引物：5’-CCCAAGACGCAAGCAAGAGGT-3’

进行PCR扩增，可获得一条长度为1715bp的特异性条带，所述特异性条带核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示；

出现上述两条特异性条带则证明被检测菌株为权利要求1所述的低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株。