[发明专利]电化学发光检测外周血循环肿瘤细胞抗原的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种电化学发光检测外周血循环肿瘤细胞抗原的方法，其特征在于：用富集缓冲液将血液样本移至离心管中，并定容，混匀；离心，弃上清，裂解红细胞并重选细胞；加富集缓冲液，重悬细胞；离心，弃上清，加入富集缓冲溶液和EpCAM抗体磁珠，混匀，孵育；将离心管静置于磁性底座后除去上清液；加入清洗缓冲液，洗涤后得磁性微球体系；之后将Ru(bpy)2(dcbpy)NHS-肿瘤细胞抗体加到磁性微球体系中，混匀，孵育；将离心管静置于磁性底座上，除去上清液；加入清洗缓冲液，洗涤；置于电致化学发光检测仪中，测出肿瘤细胞表面抗原的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的EpCAM抗体磁珠的制备方法如下：利用搅拌器对链霉亲和素磁珠进行充分混匀，然后吸取100μL的磁珠均匀溶液，相当于1mg 磁珠；加入含有2μg 生物素标记EpCAM抗体的溶液，混匀；在室温下旋转摇床孵育；静置于磁性底座上1min，并除去上清液；加入清洗缓冲液，洗涤，然后静置于磁性底座上1min，并除去上清；加入保存缓冲液，混匀，于4℃保存。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的EpCAM抗体磁珠的制备方法如下：利用搅拌器对链霉亲和素磁珠进行充分混匀，然后吸取100μL的磁珠均匀溶液，相当于1mg 磁珠；加入含有2μg 生物素标记二抗的溶液，混匀；在室温下旋转摇床孵育；静置于磁性底座上1min，除去上清液；加入清洗缓冲液，洗涤；再加入EpCAM抗体溶液，混匀；在室温下旋转摇床孵育；静置于磁性底座上1min，并除去上清液；加入清洗缓冲液，洗涤；然后静置于磁性底座上1min，并除去上清；加入保存缓冲液，混匀，于4℃保存。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的肿瘤细胞抗体为Her2抗体。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS的合成方法如下：首先分别称取0.2g二氯二联吡啶钌Ru(bpy)₂Cl₂，0.2gNaHCO₃和0.15g 2,2'-联吡啶-4,4'二羧酸(dcbpy)置于100mL圆底烧瓶中，加入40mL80%甲醇，混合溶液在硅油浴80℃下加热回流l0h，所得溶液在冰浴中冷却2h，边冷却边用1mol/L的H₂SO₄将pH值精确调节到4.4，形成的沉淀用滤纸过滤，再用甲醇洗涤沉淀3次，每次用量2-3mL，过滤后取滤液，向所得滤液中加入6.25mL7.44×10^-4 mol/L的NaPF₆溶液，并在磁力搅拌器上搅拌30min使其混合均匀，然后将上述溶液置于冰箱中4℃下挥发其滤液，10天后将其过滤，用甲醇洗涤沉淀3次,每次用量2-3m，得到的晶体再用甲醇进行重结晶，收集重结晶得到的紫红色结晶即为Ru(bpy)₂(dcbpy)(PF₆)₂；分别称取0.46g (2.2mmol)二环乙基碳二亚胺(DCC)和0.24g (2.1mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解于3mL无水DNF中并进行搅拌，然后放在冰水混合物中冷却，再称取0.31g的Ru(bpy)₂(dcbpy)(PF₆)₂溶解于2 mL的DNF中，上述两种溶液在冰浴条件下混匀，置于25℃水浴中磁力搅拌5h，所得沉淀通过吸滤装置除去，滤液中含有活性的Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS-肿瘤细胞抗体制备方法如下：向离心管中依次加入50μL 2.0×10^-5mol/肿瘤细胞抗体，50μL的1.93×10^-2mol/L Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS，10μL的DMF和388μL0.lmol/L的碳酸盐缓冲液(pH9.2)，室温搅拌孵育6h，可以得到Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS-肿瘤细胞抗体；然后通过超滤离心除去溶液中过量的Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS，得到纯的Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS-肿瘤细胞抗体。