[发明专利]一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变的检测方法及试剂盒

说明书

本发明涉及一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变的检测方法及试剂盒及其应用。所述的检测方法包括步骤：提取检测对象的全基因组DNA；采用PCR引物对Ⅰ、PCR引物对Ⅱ、PCR引物对Ⅲ和PCR引物对Ⅳ对得到的全基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对得到的PCR扩增产物进行分析，判断待检测的样本全基因组DNA中的脊髓性肌萎缩症相关基因的四个位点是否存在突变；所述的试剂盒包括PCR引物对Ⅰ、PCR引物对Ⅱ、PCR引物对Ⅲ和PCR引物对Ⅳ；本发明的检测方法及试剂盒设计巧妙，在节约样本的同时可对三种基因进行检测，且检测快速、准确、简便，从而可作为医师诊断、治疗和用药的参考依据，适于大规模推广应用。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，特别涉及一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变的检测方法及试剂盒及其应用。

背景技术

进行性脊髓性肌萎缩症(SMA)又称脊髓性肌萎缩、脊肌萎缩症，是一类由脊髓前角运动神经元和脑干运动神经核变性导致肌无力、肌萎缩的疾病。脊髓性肌萎缩症是一种常见的神经系统常染色体隐性遗传病，居致死性常染色体隐性遗传病的第二位，活产婴儿中患者发生率为1/6000-1/10000，该疾病的基因携带者频率为1：40-1：60。SMA可分为3型：SMAI型，又称婴儿重型、Werdnig-Hoffmann病，患儿出生后6个月内发病，全身性严重肌无力及肌张力减低，无倚托不能坐，常在2岁前死于呼吸肌麻痹；SMAII型，又称中间型，婴儿于出生后6-18个月发病，能坐，但不能无扶助站立，其生存时间依赖于呼吸肌受累麻痹的程度；SMAIII型，亦即慢性型，又称Kugebug-Welander病，多于出生18个月后发病，婴儿可独立行走，病情进展缓慢，可存活至成年。共同特点是脊髓前角细胞变性，临床表现为进行性、对称性，肢体近端为主的广泛性弛缓性麻痹与肌萎缩。智力发育及感觉均正常各型区别是根据起病年龄，病情进展速度，肌无力程度及存活时间长短而定至今本病尚无特异的有效治疗，主要治疗措施为预防或治疗各种严重肌无力产生的并发症如肺炎、营养不良、骨骼畸形行动障碍和精神社会性问题等。脊肌萎缩症目前临床上尚无有效的治疗办法。

脊髓性肌萎缩症的致病基因为SMN基因，该基因定位于5q13，5q13区域共包含SMN基因、神经元凋亡抑制蛋白(NAIP)，编码基本转录因子IIH亚单位2号多肽(GTF2H2)和H4F5基因，经研究发现，SMN基因为脊髓性肌萎缩症的致病基因，其余3种基因均为修饰基因。如NAIP基因全长70kb，包括16个外显子和15个内含子，编码的NAIP蛋白通过阻断细胞信号转导通路中的caspase-3和caspase-7的激活抑制神经细胞凋亡，NAIP蛋白功能缺失，使前角运动细胞凋亡过度，导致运动神经元受损，引起继发性肌肉萎缩，加重SMA病情。目前，SMN1基因c.840位点C>T纯合突变已经广泛应用于SMA疾病的临床诊断。近年来研究发现NAIP和GTF2H2基因的部分外显子缺失如NAIP的第4和第5外显子，GTF2H2的第10外显子的缺失与SMA患者的预后密切相关，SMN1基因突变导致SMN蛋白功能丧失为SMA确诊指标，NAIP和GTF2H2基因功能状态影响疾病临床表型的严重程度，检测NAIP和GTF2H2基因是否存在外显子缺失对指导临床治疗改善患儿预后有积极的意义。所以同时检测SMN、NAIP和GTF2H2三个基因目的片段的缺失或多拷贝的数量不仅可以准确诊断SMA，并且对分析估测SMA的临床表型十分必要。

SMA疾病常用的检测方法有多重连接探针扩增法(Multiplexligation-dependentprobeamplification,MLPA)和基因序列测序法(SangerSequencing)。多重连接探针扩增法为SMA实验室诊断的金标准，但DNA模板量需要比较大(总量在250ng以上)，检测周期比较长(一般5-7天)，且实验需要专业昂贵的仪器，不适合大范围推广作为临床常规检测。基因序列测序法主要检测SMN基因c.840位点是否存在C>T纯合突变来判断SMN基因是否能在后期生理过程中发挥功能，但基因测序方法检测周期比较长(一般5-7天)，且实验需要专业昂贵的仪器，不适合大范围推广作为临床常规检测。