[发明专利]一种杏鲍菇原生质体制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种杏鲍菇原生质体制备方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

鲍菇(Pleurotus eryngii)又称刺芹侧耳、雪茸，是近年来引入我国栽培的一种大型珍稀食用菌，因其在鲜菇时具有淡杏仁味，加工后材质如鲍鱼而得名。杏鲍菇在食用价值和保健价值上比传统菌菇均高出一筹，素有“平菇之王”的美誉。其肉质肥嫩，适合东西方烹调手法，加工后口感脆韧，呈白至奶黄色，外观好,是一种高蛋白、低脂肪的营养食品。此外，杏鲍菇还具有很高的药用和保健价值。杏鲍菇是一种极具开发潜力的优质食用菌，其营养和经济价值在国内、国际市场上被普遍看好，具有很好的发展前景。目前杏鲍菇的研究热点包括优良杏鲍菇菌种的选育和通过原生质体融进行育种。随着原生质体研究的不断深入，原生质体融合技术和紫外诱变等育种手段应用于食用菌的菌株改良或品种选育上。高效的制备原生质体是原生质体融合和紫外诱变等育种手段的前提条件。由于食用真菌的细胞壁的特殊结构，其原生质体制备的难度较大。迄今为止，国内外鲜有关于杏鲍菇育种中原生质体制备的报告。

发明内容

一种杏鲍菇原生质体制备方法，其特征在于，步骤如下：

1)将蜗牛酶和纤维素酶溶解于稳渗剂，微孔滤膜过滤除菌后作为酶液备用；

2)用稳渗剂清洗杏鲍菇液体培养基中的菌丝，离心后收集湿菌体；

3)将湿菌体加入步骤1)制备的酶液，35℃-40℃水浴酶解3-5小时。

步骤1)的酶液中加入了γ谷氨酰半胱氨酸，γ谷氨酰半胱氨酸含量为0.1％-0.5％。

步骤1)中蜗牛酶含量为1％-3％，优选含量为3％；纤维素酶含量为1％。

步骤1)的酶液pH为5.5。

步骤3)中水浴温度为37℃。

步骤3)中酶解时间为3小时。

步骤2)和步骤3)中所述稳渗剂为甘露醇、蔗糖、氯化钾、硫酸镁或葡萄糖中任一一种，优选稳渗剂为甘露醇，含量为6mol·L^-1。

杏鲍菇培养方法先采用PDA固体培养基培养。培养完成后，在超净工作台无菌条件下，用灭菌的接种铲挑取3块边长为0.6mm的菌块于摇瓶种子培养基中，培养基的量为150mL/500mL，将接种好的培养基于25℃，黑暗条件下静置2d，然后移入恒温摇床中培养，温度为25℃、转速140r/min，振荡培养4d。在超净工作台无菌条件下移液枪将摇瓶种子液按10％(v/v)的接种量接入发酵种子培养基中，将接种好的培养基于25℃，黑暗条件下静置2d，然后移入恒温摇床中培养，温度为25℃、转速140r/min，振荡培养4d。

本发明有益效果：

采用本发明方法，原生质体产量最高可达10⁵个·mL^-1。本发明为杏鲍菇原生质体融合选育工作奠定了技术基础，对杏鲍菇高产菌株选育具有重要的价值。

附图说明

图1 pH对原生质体产量的影响。

图2酶解时间对原生质体产量的影响。

图3温度对原生质体产量的影响。

图4稳渗剂种类对原生质体产量的影响。

图5酶浓度对原生质体产量的影响。

图6菌龄对原生质体产量的影响。

具体实施方式

实施例1：

取培养4d的菌丝，以6mol·L^-1甘露醇做稳渗剂，用0.1mol·L^-1的HCl和NaOH调节pH为4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，每个pH三个平行，结果如图1所示。

由图1可知，pH值对原生质体的制备同样有较大的影响。酶的活性对pH值很敏感，从而产生对酶解细胞壁的影响。蜗牛酶最适pH5.8-7.2，纤维素酶最适pH4.0-5.0.参考其他文献实际操作最适pH是4.8。由图1数据可看出：当pH值为5.5时，原生质体的产量相对较高，达2.0×10⁴个·mL^-1，而pH＞5.0或＜6.5，原生质体产量下降。

实施例2：

取培养4d的菌丝，以6mol·L^-1甘露醇做稳渗剂，pH5.5，酶解时间分别控制1、2、3和5小时，每个时间三个平行样，镜检计数，结果如图2所示。